A coloração imunohistoquímica usa anticorpos para detectar um antígeno em células ou tecidos. O maior benefício da imuno-histoquímica (IHC) é a capacidade de ver o alvo desejado numa amostra de tecido enquanto mantém o contexto espacial e a arquitectura do tecido.
Immunohistochemistry (IHC) Staining: Definição curta
Tipos de coloração
A coloração por imuno pode ser realizada direta ou indiretamente. Conjugando nossos anticorpos validados por aplicação a um número de fluoróforos permite a etiquetagem direta. Para navegar em nossa oferta de conjugados diretos, clique aqui.
A maioria das vezes baseado em níveis de expressão de antígenos e acessibilidade, um conjugado direto não é suficiente para visualizar o alvo de interesse. Nesses casos, a etiquetagem indireta é empregada usando um anticorpo secundário. O método preferido na CST é utilizar reagentes de detecção altamente sensíveis, de uma etapa, à base de polímeros específicos para coelhos ou ratos IgG.
Exemplos de coloração de IHC
Alguns exemplos de coloração de IHC realizada na CST são mostrados abaixo. Cada um dos anticorpos utilizados abaixo foi submetido ao nosso rigoroso processo de validação a fim de avaliar com confiança a detecção específica do antígeno desejado.
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684: Análise de IHC de carcinoma de pulmão humano com inclusão de parafina usando PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb.
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684: Análise por IHC do carcinoma pulmonar humano associado a parafina usando PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb.
CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb #64326: Análise IHC do carcinoma da mama humano embebido em parafina usando CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb.
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CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb #64326: Análise por IHC do carcinoma da mama humano embebido em parafina usando CD133 (D2V8Q) XP® Rabbit mAb.
α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb #19245: Análise por IHC do carcinoma endometrióide humano associado à parafina usando α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb realizado no Leica® Bond™ Rx.
α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb #19245: Análise por IHC do carcinoma endometrióide humano impregnado de parafina usando α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb realizado no Leica® Bond™ Rx.
Como é feita a coloração imunohistoquímica (IHC)?
Preparação do tecido
Procedimentos de coleta, preservação e fixação do tecido variam de acordo com a amostra ou com o alvo de interesse. A coleta e fixação do tecido afeta diretamente a integridade da amostra e seus resultados experimentais.
O fixadores de ligação cruzada, como a formalina, são freqüentemente usados para preparar amostras para IHC porque preservam a integridade estrutural do tecido, o que ajuda a manter a arquitetura do tecido. Outra opção é criopreservar (congelar) suas amostras, o que pode ser uma opção melhor se você estiver tentando detectar um alvo fosforilado.
Antigen (Epitope) Retrieval
Os fixadores usados para preservar a integridade estrutural da amostra de tecido também têm desvantagens, pois podem enterrar o epitopo que seu anticorpo foi projetado para reconhecer.
Existem métodos transversais para revelar epitopos que foram mascarados por fixação. Estes incluem a recuperação de antígenos induzidos por proteolíticos, que depende de uma enzima como a proteinase K, ou a recuperação de epitopos induzida pelo calor (HIER), que usa o calor para quebrar ligações cruzadas e desenrolar as proteínas. Ambos os métodos podem desmascarar epitopos, tornando-os acessíveis ao anticorpo primário e passíveis de coloração pelo IHC.
No CST, o nosso método mais comum de recuperação de antígenos é o HIER. Entretanto, nossos cientistas testam múltiplos métodos de recuperação de antígenos para determinar as condições ideais para o uso de cada anticorpo no IHC. O protocolo recomendado pela CST pode ser encontrado na folha de dados de qualquer anticorpo validado por IHC.
Antibody Binding
Selecionar o anticorpo certo é um dos passos mais críticos para obter um resultado IHC bem sucedido. Todos os anticorpos validados por IHC da CST são verificados não apenas como tendo um sinal forte no tecido, mas passam por um rigoroso procedimento de validação para confirmar a especificidade do sinal. Nossos cientistas, especializados em IHC, testam um grande número de anticorpos e recomendam apenas aqueles mais adequados para a aplicação.
Clique aqui para navegar pelos anticorpos validados por IHC para o seu alvo.
Sistemas de detecção
A coloração de IHC permite 2 amplas classes de detecção: 1) cromogénica e 2) fluorescente. Para a detecção cromogénica, CST recomenda o uso de sistemas baseados em polímeros que evitam as limitações do sistema baseado na biotina, ao mesmo tempo que aumentam a sensibilidade do ensaio.
Try SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, coelho) #8114 ou SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, rato) #8125 dependendo da espécie hospedeira do seu anticorpo primário.
Detecção à base de polímero é mais sensível do que os sistemas à base de biotina. Análise de IHC de carcinoma de pulmão humano com inclusão de parafina usando Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579 e detecção à base de biotina (esquerda) ou de polímero (SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114; direita). Como mostrado, a detecção à base de polímero oferece maior sensibilidade e resulta em uma coloração mais robusta.
A detecção à base de polímero é mais sensível do que os sistemas à base de biotina. Análise de IHC de carcinoma de pulmão humano com inclusão de parafina usando Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579 e detecção à base de biotina (esquerda) ou de polímero (SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114; direita). Como mostrado, a detecção à base de polímero oferece maior sensibilidade e resulta em uma coloração mais robusta.
Nem todo o substrato DAB tem o mesmo desempenho. Análise de IHC do carcinoma da mama humano embebido em parafina usando Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145. A detecção cromogênica foi realizada usando o SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 (esquerda), DAB fornecido pelo concorrente 1 (meio), ou DAB fornecido pelo concorrente 2 (direita). Embora o concorrente 2 DAB produza um sinal comparável ao SignalStain® DAB Substrate Kit, o concorrente 1 DAB resulta em um sinal muito mais fraco.
Nem todo o substrato DAB tem o mesmo desempenho. Análise do IHC do carcinoma da mama humano embebido em parafina usando Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145. A detecção cromogênica foi realizada usando o SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 (esquerda), DAB fornecido pelo concorrente 1 (meio), ou DAB fornecido pelo concorrente 2 (direita). Embora o concorrente 2 DAB produza um sinal comparável ao SignalStain® DAB Substrate Kit, o concorrente 1 DAB resulta em um sinal muito mais fraco.
Counterstaining
Após a detecção de anticorpos, muitos pesquisadores preferem contra-manchar o tecido para visualizar a anatomia celular e orientar o espectador com relação à coloração específica. Na CST, nós contra-manchamos nossas amostras usando Hematoxilina #14166, que coloriza o núcleo de azul. Ao escolher uma contra-mancha, é importante que a contra-mancha seja compatível com o seu cromógeno. Por exemplo, se a cor da contra-mancha for muito similar à cor cromogênica, o sinal de anticorpos será difícil de reconhecer.
Protocolo de coloração de imunohistoquímica (IHC)
Below é uma visão geral do nosso protocolo recomendado e destacados são os passos chave para uma experiência bem sucedida. CST visa ajudá-lo a melhorar sua análise IHC, fornecendo anticorpos e reagentes validados para permitir que você siga um protocolo simples e específico do produto e alcance resultados reprodutíveis com a otimização mínima necessária.
Veja o vídeo do protocolo IHC ou visite nossa página de seleção de protocolo.