A especificidade é uma propriedade da enzima e descreve quão restritiva a enzima é na sua escolha do substrato; uma enzima completamente específica teria apenas um substrato.
A especificidade das proteases serinas não é normalmente muito elevada uma vez que elas têm sítios activos semelhantes e actuam através do mesmo mecanismo proteolítico.
Consequentemente, uma única protease serina pode actuar em vários substratos embora a ritmos diferentes. A forma como o substrato se encaixa no local ativo da enzima é de importância crucial para o resultado da reação enzimático-substrato. A ligação a ser clivada deve ter uma orientação específica em relação às cadeias laterais de aminoácidos da tríade catalítica. O fator mais importante que governa o ajuste de um substrato para uma enzima é a sequência de aminoácidos ao redor da ligação a ser clivada.
Trypsin cliva-se amidas e ésteres dos aminoácidos básicos arginina e lisina. A trombina tem uma preferência semelhante, mas é mais específica para a arginina do que para a lisina.
Selectividade é uma propriedade do substrato e indica o grau a que o substrato está ligado e clivado por diferentes enzimas. A melhor medida de selectividade é dada pela razão kcat/Km. Os substratos sintéticos são consideravelmente menores que os substratos naturais e podem ser clivados por mais de uma enzima, isto é, os substratos sintéticos não são completamente selectivos. A explicação para isto é que grandes substratos como o fibrinogênio não só interagem com o local ativo, mas também com os domínios exteriores da enzima. Tais interações permitem aos substratos discriminar entre diferentes proteases serinas e fibrinogênio, tornando-se assim altamente seletivos para trombina.
Tabelas de seletividade
Os dados de seletividade da tabela foram compilados para permitir ao investigador entender como uma enzima contaminante influenciaria a reação enzima-substrato em estudo. Outra forma de expressar isto é dizer que a tabela mostra as reatividades relativas de duas ou mais enzimas em um substrato em particular. A tabela deve ser lida horizontalmente. Cada linha representa a reatividade de um substrato designado para uso com uma determinada enzima, indicada à esquerda, em relação a outras enzimas relevantes.
Exemplo: O conjunto de dados na linha superior mostra a reatividade relativa do substrato da trombina S-2238™ com várias enzimas. Todos os experimentos foram realizados usando o mesmo tampão, ou seja, o mais apropriado para a reação entre a trombina e o substrato cromogênico S-2238™. Além disso, a concentração do substrato foi sempre a mesma, ou 2 x Km para a reação do substrato cromogênico S-2238™ com a trombina. As concentrações das diferentes enzimas são apresentadas na Tabela 2 e estão relacionadas com a concentração plasmática do zimogénio correspondente. A reatividade do substrato cromogênico S-2238™ com trombina, medida como o aumento da absorvância dependente do tempo (ΔA/min), é dado o valor 100% (o valor real de ΔA/min é dado entre parênteses). As reatividades do substrato cromogênico S-2238™ com as enzimas FXa, FXIa, APC, plasmin, single chain t-PA, plasma kallikrein e C1s foram então relacionadas à reatividade do substrato cromogênico S-2238™ com trombina, e provaram ser 5, 5, 40, 5, 5, 60, e 2%, respectivamente.