GFP
Proteína Fluorescente Verde (GFP) é um único produto genético polipéptido de 238 aminoácidos descobertos na medusa Aequorea victoria. A proteína tem uma fluorescência verde natural sob condições de iluminação específicas. A proteína deriva a sua bioluminescência da ciclização Ser-Tyr-Gly dentro da sua sequência de aminoácidos primários. A GFP é bastante estável e suporta vários tratamentos químicos e procedimentos.1 A primeira demonstração de que esta proteína fluorescente poderia ser expressa num sistema heterólogo foi em C. elegans.2 Desde então, a GFP tornou-se um gene de escolha dos repórteres porque não requer transformação bioquímica, agente de contraste ou o uso de radiação ionizante nociva para ser visualizada.3 Desde aquele relatório inicial, a expressão do gene reportador GFP tem sido relatada em múltiplos organismos, incluindo ratos.4 Além disso, sob a direção de um promotor específico, os ratos transgênicos GFP podem expressar a proteína fluorescente de uma forma específica de um tecido e até mesmo de uma célula. A visualização não invasiva é a chave para poder monitorar os processos fisiológicos e bioquímicos in vivo e em tempo real.5
Existem inúmeras maneiras de visualizar a bioluminescência da GFP. Uma maneira de detectar a fluorescência é com uma luz UV de mão (365 nM). Há vários modelos oferecidos pela Fisher em uma faixa de preço de cerca de $100 a $200. O método de luz UV portátil não funciona muito bem para a estirpe transgênica GFPX (Stock 003116). Dr. Andras Nagy, doador investigador de transgênicos GFPX e GFPU (Stock 003115 e 003116), descreve um fone de ouvido e um filtro adaptável ao microscópio que agora estão disponíveis comercialmente.
CFP e YFP
Avanços recentes melhoraram as características e utilidade do GFP como um gene repórter. A GFP melhorada (EGFP) foi projetada para ser expressa em níveis mais elevados em células de mamíferos e para fluorescer mais intensamente. Proteína Fluorescente Ciano (CFP) e Proteína Fluorescente Amarela (YFP) são variantes espectrais da GFP que permitem que múltiplos tipos de células sejam rotuladas simultaneamente.
Cubitt AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gross LA, Tsien RY. 1995. Compreender, melhorar e usar proteínas fluorescentes verdes. Tendências Biochem Sci 20:448-55.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. 1994. Proteína fluorescente verde como marcador de expressão gênica. Ciência 263:802-5.
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Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. 1997. Ratos verdes’ como fonte de células verdes ubíquas. FEBS Lett 407:313-9.
Yang M, Baranov E, Jiang P, Sun FX, Li XM, Li L, Hasegawa S, Bouvet M, Al-Tuwaijri M, Chishima T, Shimada H, Moossa AR, Penman S, Hoffman RM. 2000. Imagens de corpo inteiro de tumores e metástases fluorescentes verdes. Proc Natl Acad Sci USA 97:1206-11.
lacZ
O uso de um gene repórter pode permitir o exame de padrões espaciais de expressão gênica de um promotor particular dentro de um tecido, embrião ou rato adulto.1 O gene E. coli lacZ, quando integrado ao genoma do rato por técnicas transgênicas, pode ser usado como um gene repórter sob o controle de um determinado promotor/ reforçador em um cassete de expressão transgênica. O gene lacZ codifica a beta-galactosidase, que catalisa a clivagem da lactose para formar galactose e glicose. A atividade da beta-galactosidase pode ser identificada por técnicas in situ e in vitro quando incubada com o substrato da beta-galactosidase X-gal. A beta-galactosidase cliva X-gal, um substrato cromogênico, resultando em um corante azul insolúvel, permitindo assim a identificação de células com atividade lacZ.2 Animais transgênicos podem então ser usados para identificar fatores e condições que modulam o perfil de expressão do promotor ou melhorador.