Resultados e Discussão
Dois modos de clivagem de DNA por R.KpnI na presença de Mg2+.
R.KpnI é uma REase altamente promíscua em reações catalisadas por Mg2+ ao contrário da maioria das outras REases (11, 12). Na Fig. 1 A, o padrão característico de clivagem por R.KpnI é mostrado em uma faixa de concentrações de Mg2+. Em concentrações mais baixas do íon metálico (50-500 μM), apenas a clivagem da seqüência cognata foi observada (faixas 2-5). Entretanto, em concentrações de Mg2+ >500 μM, a clivagem promíscua foi evidente (faixas 6-9). Os modos específicos e promíscuos de clivagem por R.KpnI dependendo da concentração de Mg2+ foram substanciados pela análise da clivagem dos oligonucleotídeos. O substrato oligonucleotídeo contendo a sequência canónica foi clivado eficientemente por R.KpnI mesmo a 20 μM Mg2+. Em contraste, as sequências não canônicas foram clivadas eficientemente apenas a >500 μM Mg2+ . Estes resultados implicaram que o R.KpnI apresenta dois perfis diferentes de activação metálica – um para os substratos de ADN canónico e outro para os nãocanónicos. A enzima segue um perfil hiperbólico de ativação metálica para o substrato canônico e um padrão sigmoidal para o substrato não-canônico (Fig. 1 B). Estes dados foram submetidos à análise de Hill plot (Fig. S2; e ver Texto SI ), e o coeficiente de Hill para a ligação iônica metálica é apresentado na Tabela 1. A análise de Hill plot revelou a ligação de íons metálicos adicionais à enzima e o seu papel na clivagem de sequências nãocanônicas. Assim, o recrutamento de um íon metálico adicional próximo ou distante do local ativo da enzima parecia ser necessário para induzir a clivagem promíscua pela enzima. Se esse for o caso, a mutação dos resíduos envolvidos na coordenação do íon metálico do segundo local deve abolir a atividade promíscua, resultando em uma enzima altamente específica da seqüência. Testamos esta hipótese.