Selecção de enzimas para a biossíntese de cinamaldeído
Cinnamaldeído pode ser sintetizado a partir da l-fenilalanina e a sua biossíntese requer três reacções enzimáticas: (i) desaminação da l-fenilalanina em ácido cinâmico por fenilalanina-amónia-liase (PAL, EC 4.3.1.24), (ii) ligadura ácido-tiol de ácido cinâmico a cinamoyl-CoA por 4-coumarate:CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12), e (iii) redução de cinamoyl-CoA a cinamaldeído por cinamoyl-CoA redutase (CCR, EC 1.2.1.44) (Fig. 1a) . PAL é uma enzima ubíqua que pode ser encontrada em muitas plantas, fungos e algumas bactérias, e abriga diversas atividades e especificidades de acordo com a origem da enzima . Examinamos duas enzimas PAL, uma da planta Arabidopsis thaliana (AtPAL) e outra da bactéria Streptomyces maritimus (SmPAL), pela sua adequação para produzir ácido cinâmico em E. coli. No caso do AtPAL, existem quatro isômeros incluindo AtPAL1 a AtPAL4, e foi relatado anteriormente que a maioria deles (AtPAL1, 2, e 4) tem atividades similares às do AtPAL3 a l-fenilalanina como substrato, então selecionamos AtPAL1 como um representante da fonte vegetal. Suas constantes cinéticas (Km) foram relatadas como sendo 68 e 23 μM, respectivamente. Cada enzima PAL com a marca His foi produzida em E. coli BL21(DE3) e purificada de acordo com os procedimentos descritos em “Métodos”. Ambas as enzimas, AtPAL1 (78 kDa) e SmPAL (56 kDa), foram purificadas com sucesso (arquivo adicional 1: Figura S1). Embora o nível de expressão do AtPAL1 não fosse tão alto que a banda não pudesse ser vista nas pistas 1 e 2 da SDS-PAGE, a banda do AtPAL1 podia ser claramente vista após cromatografia em coluna de afinidade na pista 3 na qual o eluato concentrado foi carregado. A molaridade equivalente de cada enzima PAL purificada foi incubada com a mesma quantidade de l-fenilalanina (como substrato), e o título de produção de ácido cinâmico foi quantificado por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (arquivo adicional 2: Figura S2). Como mostrado na Fig. 1b, SmPAL exibiu atividade significativamente maior (21 vezes a 30 °C de reação e 27 vezes a 37 °C de reação) do que as de AtPAL1.
Biossíntese de cinamaldeído e ensaio in vitro de enzimas de síntese. a Três reacções enzimáticas (PAL, 4CL e CCL) para a biossíntese de cinamaldeído a partir de l-fenilalanina. b Ensaio in vitro de PAL de A. thaliana (AtPAL1, preto) e S. maritimus (SmPAL, branco) a 30 e 37 °C. c Ensaio in vitro de 4CL e CCL a 30 e 37 °C. Duas combinações incluindo (i) 4CL de A. thaliana (At4CL1) e CCR de A. thaliana (AtCCR), e (ii) CCL de S. coelicolor (ScCCL) e CCR de A. thaliana (AtCCR) foram misturadas com ácido cinâmico e foi analisada a produção de cinamaldeído. As barras de erro representam desvio padrão da média (n = 2)
Também examinamos duas enzimas 4CL diferentes, uma de Streptomyces coelicolor (ScCCL) e outra de A. thaliana (At4CL), por sua adequação para converter ácido cinâmico em cinamaldeído em E. coli. No caso do At4CL, sabe-se que existem 14 isoformas putativas (At4CL1-At4CL14) . Entre 14 isoformas, At4CL1-3 têm atividades similares à canela, enquanto o resto das isoformas não . Portanto, selecionamos At4CL1 como um representante. Também utilizamos a enzima CCR de A. thaliana (AtCCR1) para a conversão de cinamoyl-CoA em cinamaldeído . Cada enzima 4CL (At4CL1 e ScCCL ) foi testada em combinação com a enzima CCR de A. thaliana (AtCCR). Todas as enzimas foram purificadas com sucesso com alta pureza (arquivo adicional 1: Figura S1). Para comparar as actividades enzimáticas de At4CL1 e ScCCL, duas reacções, (i) At4CL1 com AtCCR e (ii) ScCCL com AtCCR, foram preparadas e misturadas com ácido cinâmico como substrato. Após incubação a 30 e 37 °C, o título de cinamaldeído foi analisado por HPLC. Como mostrado na Fig. 1c, a combinação de ScCCL e AtCCR resultou em um maior título de produção de cinamaldeído (4,4 vezes na reação a 30 °C e 10,4 vezes na reação a 37 °C) do que a combinação de At4CL1 e AtCCR. Com base nestes resultados, construímos um sistema de biossíntese de cinamaldeído em E. coli como descrito abaixo, utilizando as seguintes enzimas: SmPAL, ScCCL, e AtCCR.
Construção da via de biossíntese de cinamaldeído em E. coli
Produzir cinamaldeído em E. coli, SmPAL, ScCCL, e AtCCR genes foram clonados em pTrc99A na seguinte ordem: SmPAL, ScCCL, e AtCCR (produzindo pHB-CAD) (Fig. 2a). A E. coli W3110 que abriga o pHB-CAD foi cultivada a duas temperaturas diferentes (30 e 37 °C) para encontrar a temperatura ideal para a produção de canela. A expressão das enzimas foi analisada pela SDS-PAGE, seguida pela análise de western blot, conforme descrito em “Métodos”. Em ambas as temperaturas, todas as enzimas foram expressas bem e altamente solúveis (Fig. 2b). Embora cada enzima tenha sido expressa em um nível diferente, a expressão de cada enzima foi marginalmente melhor a 37 °C do que a 30 °C. Também, a análise do título de produção de cinamaldeído produzido no meio de cultura usando HPLC revelou que o título de produção de cinamaldeído era 4,5 vezes maior a 37 °C do que a 30 °C (Fig. 2c). Supomos que o maior título de produção de cinamaldeído a 37 °C foi causado pelo aumento do nível de expressão de todas as enzimas biossintéticas a 37 °C ativamente, mesmo que essas enzimas estejam ativas a 30 °C . A partir daí, todos os cultivos para a produção de cinamaldeído foram realizados a 37 °C.
A construção do sistema de expressão, produção de cada enzima e cinamaldeído em E. coli. a O diagrama esquemático de pHB-CAD plasmídeo para a expressão de três genes de síntese (SmPAL, ScCCL e AtCCR) sob o promotor trc induzível por IPTG (Ptrc). RBS significa que foram designados os sítios de ligação do ribossomo para a tradução e sítios de enzimas de restrição. b Análise de Western blot da expressão gênica sob duas temperaturas diferentes (30 e 37 °C). Para a detecção de SmPAL (faixas 1-4), foi usado anticorpo anti-FLAG-HRP e para a detecção de ScCCL e AtCCR (faixas 5-8), foi usado anticorpo anti-His-HRP. As faixas 1, 3, 5 e 7 indicam a fração proteica total, e as faixas 2, 4, 6 e 8 indicam as frações proteicas solúveis. As pistas 1, 2, 5, e 6 indicam amostras a 30 °C, e as pistas 3, 4, 7, e 8 indicam amostras a 37 °C. Símbolos: Ponta de seta fechada, SmPAL; ponta de seta aberta, ScCCL; seta sólida, AtCCR. c Análise por HPLC de cinamaldeído produzido sob duas temperaturas diferentes. As barras de erro representam o desvio padrão da média (n = 3)
Estrutura para aumentar o pool intracelular de l-fenilalanina
Para a biossíntese da cinamaldeído, a l-fenilalanina é necessária como um precursor essencial . Portanto, para aumentar a produção de cinamaldeído, é desejável aumentar o pool intracelular de l-fenilalanina. Para este fim, re-desenhamos racionalmente a E. coli para produzir mais l-fenilalanina. Usando as informações metabólicas e regulamentares disponíveis como guia, nós projetamos a E. coli W3110 da seguinte forma: (i) eliminação do gene crr que codifica a proteína EIIAGlc relacionada com o sistema fosfoenolpiruvato de fosfo-transferase (PTS) para moderar a taxa de absorção do substrato, diminuir o excesso de metabolitos e o enriquecimento de precursores, (ii) eliminação do gene TyrR para aliviar a regulação apertada do regulador TyrR que contém genes de síntese de aminoácidos aromáticos (AAA), (iii) deleção dos genes trpE (anthranilate synthase component) e tyrA para prevenir a perda do fluxo de carbono em vias concorrentes (biossíntese de l-triptofano e l-tirosina), e (iv) deleção do gene pykA (piruvate kinase A) para enriquecer o precursor e equilibrar o fluxo entre crescimento e produção de l-fenilalanina (Fig. 3). Com base no esquema acima, cinco mutantes sequenciais de E. coli W3110 foram desenvolvidos (YHP01-YHP05) (Tabela 1).
O diagrama esquemático da engenharia de deformação para aumentar o pool de l-fenilalanina em E. coli W3110. O símbolo “X” indica a eliminação do gene correspondente. As setas de cor vermelha indicam a superexpressão dos genes relevantes (galP, glk, aroG, ydiB, aroK, pheA) via sistema de expressão baseado em plasmídeos (pYHP)
Primeiro, um PTS fosfenoenolpiruvato específico de glucos foi inativado pela deleção do gene crr em E. coli W3110, produzindo E. coli YHP01. Embora isso interrompa o sistema principal de internalização da glicose, YHP01 ainda pode crescer em meios definidos contendo glicose como única fonte de carbono, pois a PTS específica do homem e a permease da galactose podem continuar a internalizar a glicose no citoplasma. Contornar a PTS resulta em um aumento do pool de fosfoenolpiruvato (PEP), o que acaba por facilitar a síntese de l-fenilalanina . Em seguida, eliminamos o gene tirR em YHP01 para produzir a cepa YHP02. A proteína TyrR é um regulador do TyrR regulon, que contém oito genes envolvidos na biossíntese de AAA . A sua eliminação também pode aumentar o pool de l-fenilalanina, aliviando a regulação apertada dos genes relacionados com a síntese de AAA. Em seguida eliminamos sequencialmente os genes trpE e tyrA começando com a cepa YHP02, produzindo as cepas YHP03 e YHP04, respectivamente. Na via de biossíntese dos AAA, ocorre um ponto final do ramo onde o corismate pode ser convertido em l-fenilalanina, l-triptofano ou l-tirosina pelas enzimas PheA, TrpE ou TyrA, respectivamente . As deleções dos genes trpE e tyrA podem prevenir a perda de carbono em vias concorrentes para a biossíntese de l-triptofano e l-tirosina. Finalmente, eliminamos o gene pykA em YHP04 para produzir a cepa YHP05. O gene pykA codifica a piruvate kinase A (PykA), que constitui o segundo passo de consumo de PEP. Ao eliminar o gene pykA, mais PEP pode ser usada na via do xiquimato e, consequentemente, mais quantidade de l-fenilalanina pode ser produzida. Em cada estirpe (YHP01-YHP05), a deleção dos genes foi verificada por PCR e eletroforese em gel de agarose (arquivo adicional 3: Figura S3).
Todas as estirpes de E. coli projetadas, incluindo YHP01-YHP05 e a E. coli parental W3110, foram cultivadas em frascos agitadores contendo meios semi-definidos, e o crescimento celular e a produção de l-fenilalanina foram comparados. Após o cultivo por 48 h, todas as linhagens projetadas cresceram ligeiramente melhor que a linhagem W3110; em particular, a linhagem E. coli YHP05 exibiu a maior densidade celular (Fig. 4a). Um estudo anterior também observou que a inativação do PTS e isozimas Pyk aumentou o fluxo de carbono para a formação de biomassa, devido ao efeito da conservação de quantidades reduzidas de metabólitos intermediários resultantes da diminuição da absorção de glicose e catabolismo. Também analisamos o título de produção de l-fenilalanina no sobrenadante da cultura por HPLC. Na cepa parental W3110, o título de produção de l-fenilalanina foi de 0,24 g/L, mas o título de l-fenilalanina foi gradualmente aumentado nas cepas artificiais de E. coli (Fig. 4a). A E. coli YHP05, na qual os genes crr, tyrR, trpE, tyrA e pykA foram deletados, exibiu o maior título de produção de l-fenilalanina (0,52 g/L), que foi 2,2 vezes maior do que o da E. coli W3110 dos pais. Portanto, decidimos usar a cepa E. coli YHP05 para engenharia posterior.
Comparação da densidade óptica final (preta) e produção de l-fenilalanina (cinza) no cultivo de 48 h. a Todos os cinco E. engenhosos. coli (YHP01 a YHP05) e as cepas parentais E. coli W3110 foram cultivadas e os títulos de produção celular (OD600) e l-fenilalanina foram comparados. b A cepa E. coli YHP05 abrigando diferentes plasmídeos (série pTac15kG ou pYHP) foram cultivadas e os títulos de produção celular (OD600) e l-fenilalanina foram comparados. Barras de erro representam desvio padrão da média (n = 3)
Sistema de sobreexpressão baseado em plasmídeos para aumentar o pool intracelular de l-fenilalanina
Iniciando com a cepa E. coli YHP05, a produção de l-fenilalanina foi ainda melhorada pela sobreexpressão do gene baseado em plasmídeos. A inibição do feedback na via de síntese da l-fenilalanina pelo shikimato e l-fenilalanina foi reduzida pela superexpressão de isozimas ou pela introdução de mutações nas enzimas envolvidas na via do shikimato, como se segue: (i) superexpressão do gene sintetase 3-deoxi-d-arabinoheptulosonato 7-fosfato (DAHP) que é codificado em aroG com engenharia (AroG8/15), (ii) superexpressão dos genes ydiB e aroK que codificam a shikimate desidrogenase e shikimate quinase para melhorar o fluxo de carbono na via do shikimato, (iii) superexpressão do gene pheA que codifica CHA mutase/prefenate dehydratase com engenharia para melhorar a afinidade de ligação do substrato (PheAfbr, dm), e (iv) superexpressão dos genes galP (galactose permease) e glk (glucokinase) para facilitar a absorção de glicose (arquivo adicional 4: Figura S4).
Primeiro, para aliviar a inibição de feedback, foi construído o plasmídeo pTac15kG, que continha o gene aroG8/15. O AroG é a principal enzima envolvida na síntese de DAHP, mas o AroG é completamente inibido pela l-fenilalanina (tão baixo quanto 0,1 mM) . Sabe-se que a introdução de duas mutações (D146N e A202T) resultou em resistência à inibição de feedback sem afetar sua alta atividade específica (AroG8/15) , então exageramos essa enzima mutante AroG8/15. Em seguida, dois plasmídeos (pTac15kGB e pTac15kGBK) foram construídos para sobreexpressar os genes ydiB e aroK juntamente com o gene aroG8/15, respectivamente. O fluxo metabólico para a via do xiquimato pode ser melhorado quando a desidrogenase do xiquimato (YdiB) e a cinase do xiquimato (AroK) são sobreexpressas. Também o plasmídeo pTac15kGBKA foi posteriormente construído para expressar excessivamente o gene pheA, que codifica a mutase/prefenato desidratase corismatizada com mutações. Nesta construção, amplificamos apenas os primeiros 300 aminoácidos do tipo selvagem PheA (PheAfbr), o que exclui o domínio regulatório; portanto, o PheAfbr é pouco influenciado pela inibição de feedback. Além disso, como o PheAfbr tem um valor Km superior ao do PheA do tipo selvagem, refletindo sua menor afinidade de ligação ao substrato, introduzimos duas mutações (E159A e E232A) no PheAfbr para aumentar sua afinidade de ligação ao substrato, produzindo o PheAfbr, dm . Por último, o plasmídeo pYHP foi construído para expressar os genes galP e glk adicionalmente, que codificam a permease galactose e a glucocinase, respectivamente. Ambas as enzimas facilitam a absorção de glicose .
Após a construção de cinco plasmídeos, incluindo pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBKA, e pYHP (Tabela 1), cada plasmídeo foi transformado em E. coli YHP05. Após o cultivo por 48 h em frascos agitadores contendo meios semi-definidos, foram analisados o crescimento celular e o título de produção da l-fenilalanina. Todas as células cresceram bem, e particularmente E. coli YHP05 abrigando pYHP cresceu a uma densidade celular marginalmente maior (OD600 = 9,76) do que as outras (Fig. 4b). Também foi analisado o título de produção de l-fenilalanina no sobrenadante de cultura por HPLC. A superexpressão do gene aroG8/15 (pTac15kG) resultou em um aumento significativo na produção de l-fenilalanina (2,25 g/L) comparado com YHP05 sem plasmídeo (0,52 g/L) (Fig. 4b). A superexpressão subsequente de outros genes resultou em um aumento serial no título de produção de l-fenilalanina e a E. coli YHP05 que abrigava pYHP apresentou o maior título de produção de l-fenilalanina (3,91 g/L) (Fig. 4b). O efeito do plasmídeo pYHP resultou em um aumento significativo na produção de l-fenilalanina até 16,4 vezes e 7,5 vezes, respectivamente. No cultivo da E. coli YHP05 que abriga a pYHP, a produção de l-fenilalanina na glicose e produtividade foi de 0,270 g/g e 0,082 g/L/h, respectivamente (arquivo adicional 5: Figura S5). Assim, no projeto da E. coli YHP05 que abriga a pYHP, o pool de l-fenilalanina foi significativamente melhorado. Liu et al. relataram anteriormente a produção de l-fenilalanina em E. coli até 47 g/L . No entanto, esse recorde pôde ser alcançado no cultivo em lotes alimentados (escala 15 L) e eles empregaram a co-expressão do transportador de l-fenilalanina (YddG) para a produção eficiente de l-fenilalanina no meio de cultura. No nosso trabalho, não introduzimos o YddG porque o objectivo final do nosso trabalho não era a produção de l-fenilalanina, mas sim a produção de canela. Embora o título de l-fenilalanina alcançado em nosso trabalho não fosse o alto recorde, achamos que era suficiente para a produção de cinamaldeído. Portanto, decidimos usar esta estirpe projetada para a produção de cinamaldeído.
Produção de cinamaldeído na E. coli projetada
Usando a E. coli YHP05 projetada abrigando pYHP, primeiramente examinamos a produção de ácido cinâmico. Para este experimento, foi construído o plasmídeo pHB-CA, que contém o gene SmPAL sob o promotor trc induzível IPTG (Tabela 1). E. coli YHP05 que abriga tanto pHB-CA quanto pYHP foi cultivado em frascos por 48 h e o título de produção de ácido cinâmico foi analisado. E. coli YHP05 e E. coli W3110 abrigando pHB-CA (sem pYHP) também foram examinados como controles. Os padrões de crescimento de todas as células foram similares (Fig. 5a) e, E. coli W3110 e YHP05 abrigando pHB-CA produziram 79 e 108 mg/L de ácido cinâmico, respectivamente (Fig. 5b). E. coli YHP05 com pHB-CA e pYHP apresentaram melhora significativa no título de produção (287 mg/L), que foi 3,6 e 2,7 vezes maior do que E. coli W3110 e YHP05 com pHB-CA, respectivamente (Fig. 5b). Tanto quanto sabemos, este título de produção também foi 1,5 vezes maior que o nível mais alto (186 mg/L) relatado na E. coli . Este resultado indica claramente que a elevação da quantidade de l-fenilalanina na cepa de E. coli de engenharia contribui positivamente para aumentar a produção de ácido cinâmico.
Crescimento celular e produção de ácido cinâmico em cultivo de frascos. a Time profiles of cell growths (OD600). Símbolos: Círculo fechado, E. coli W3110 (pHB-CA); círculo aberto, E. coli YHP05 (pHB-CA); quadrado fechado, E. coli YHP05 (pHB-CA e pYHP). b Título de produção de ácido cinâmico em cada estirpe. As barras de erro representam o desvio padrão da média (n = 3)
Como objetivo principal, examinamos a produção de cinamaldeído na cepa de engenharia E. coli YHP05, que foi transformada com pHB-CAD e pYHP. Também, E. coli YHP05 e E. coli W3110 que abriga pHB-CAD (sem pYHP) foram examinados como controles. O crescimento celular foi semelhante (Fig. 6a), e três enzimas biossintéticas de cinamaldeído foram bem expressas em todas as células examinadas (arquivo adicional 6: Figura S6). Após o cultivo em frascos durante 48 h, os sobrenadantes de cultura foram coletados e os títulos de produção de cinamaldeído foram determinados por HPLC. E. coli W3110 (pHB-CAD) e E. coli YHP05 (pHB-CAD) exibiram um título de produção de canela tão alto quanto 2,18 e 6,3 mg/L, respectivamente (Fig. 6b). Pelo contrário, E. coli YHP05 (pHB-CAD e pYHP) exibiu um título de produção significativamente maior (75 mg/L), que foi 35 vezes maior do que E. coli W3110 (pHB-CAD).
Crescimento celular e produção de cinamaldeído em cultivo de frascos. a Time profiles of cell growths (OD600). Símbolos: Círculo fechado, E. coli W3110 (pHB-CAD); círculo aberto, E. coli YHP05 (pHB-CAD); quadrado fechado, E. coli YHP05 (pHB-CAD e pYHP). b Título de produção de cinamaldeído em cada estirpe. As barras de erro representam o desvio padrão da média (n = 3)
Atividade nematicida da cinamaldeído produzida por E. coli
Para avaliar a atividade nematicida da cinamaldeído produzida em meio de cultura, nematódeos, B. xylophilus, foram tratados com cinamaldeído seguindo os procedimentos descritos em “Métodos” . O sobrenadante de cultura de E. coli YHP05 abrigando pYHP e pHB-CAD foi diluído até que a concentração final de cinamaldeído fosse de 60 mg/L, e os nematódeos foram tratados com o sobrenadante de cultura diluído. Após 1 e 4 h, apenas 26% e abaixo de 18% dos nematódeos sobreviveram, respectivamente (Fig. 7). Como controle positivo, os nematódeos foram tratados com cinamaldeído disponível comercialmente e purificado a uma concentração equivalente (60 mg/L). Após 4 h, quase todos os nematódeos (95%) foram mortos. Esses resultados indicaram que as atividades dos nematódeos eram semelhantes entre a cinamaldeído comercialmente adquirido e produzido um neste estudo. Como controle negativo, o sobrenadante de cultura de E. coli W3110 também foi testado e como esperado, quase todos os nematódeos sobreviveram (>92 %) após 4 h.
Gráfico da porcentagem de nematódeo vivo (%) após o tratamento da cinamaldeído. Símbolos: Diamante fechado, sobrenadante de cultura de E. coli W3110 como controle negativo; círculo fechado, 60 mg/L comercial e purificado de cinamaldeído como controle positivo; círculo aberto, 60 mg/L sobrenadante de cultura com cinamaldeído produzido em E. coli YHP05 abrigando pYHP e pHB-CAD. As barras de erro representam o desvio padrão da média (n = 2)