Cromatografia Líquida – Espectrometria de Massa em análise de alimentos

A determinação de compostos traços orgânicos na análise de alimentos é de grande importância para a qualidade dos alimentos e aspectos de segurança alimentar. Tanto a separação do analito de potenciais inferências na matriz alimentar, como a determinação qualitativa e quantitativa do composto alvo, são passos vitais na química analítica de alimentos.

Definição

Cromatografia Líquida (LC, aqui High Performance LC – HPLC) é uma técnica de separação física para análise de traços. Ela é baseada na interação de um analito com uma fase estacionária (coluna com partículas) e uma fase móvel (eluente líquido ou uma mistura de eluentes). Espectrometria de massa (MS) é a ferramenta analítica para medir a composição de uma amostra. A MS gera informações úteis sobre o peso molecular e a estrutura dos analitos e ajuda na elucidação de compostos desconhecidos.

A combinação, LC/MS, LC-MS é uma técnica poderosa, devido à sua alta sensibilidade (até a faixa de ppt) e especificidade. Na área de análise de traços orgânicos, a MS é utilizada para muitas aplicações, mas em contraste com a GC/MS (Gas Chromatography, coupled with Mass Spectrometry), é dedicada à análise de amostras que contenham alvos analíticos não voláteis, tipicamente com uma massa entre 200 – 800u, que sejam termicamente lábil, exibam alta polaridade ou tenham uma alta massa molecular.

Princípio de trabalho

Em princípio, um dispositivo LC/MS tem que executar as quatro etapas de trabalho, incluindo:

1. Separação cromatográfica dos analitos por uma coluna de separação
2. Ionização do analito
3. Isolamento dos iões e
4. Identificação dos iões

Em geral, não é trivial fazer a interface de um sistema HPLC com um espectrómetro de massa, uma vez que a dificuldade é transformar um soluto num ião de fase gasosa. O desafio é se livrar do solvente mantendo um nível adequado de vácuo no espectrômetro de massa e gerar os íons de fase gasosa. Portanto, os componentes que saem da coluna cromatográfica são introduzidos no espectrômetro de massa através de uma interface especializada.

Os dois sistemas de interface de ionização mais utilizados, ionização química por pressão atmosférica (APCI) e ionização por eletropray (ESI) são escolhidos dependendo das propriedades físico-químicas dos analitos (ou seja, polaridade e acidez). A ionização ocorre à pressão atmosférica e ambas são consideradas como um método de ionização suave, ou seja, o espectro de massa fornece principalmente a informação do peso molecular, a menos que sejam usadas técnicas de fragmentação.

Desde que os compostos sejam parcialmente co-elutados do sistema cromatográfico, a atribuição clara dos fragmentos individuais não pode ser feita usando apenas LC-MS, onde apenas massas moleculares de íons estão disponíveis. Para superar este problema, a espectrometria de massa tandem (MS/MS), que envolve múltiplas etapas de seleção ou análise de massa, é atualmente utilizada principalmente (LC/MS/MS ou LC/MSn). Estes sistemas são capazes de determinar resíduos na faixa de ppt inferior. Para a qualificação de moléculas orgânicas, é necessária uma configuração técnica diferente de MS. Uma abordagem possível para a qualificação é o uso de uma EM que gera íons, levando-os a uma armadilha linear de íons e depois armazenando-os em um campo de radiofrequência. A partir daí, diferentes possibilidades técnicas permitem a qualificação dos íons e, portanto, do composto desconhecido.

Aplicações

Desde sua introdução na análise de rotina há cerca de dez anos, a LC/MS foi estabelecida na maioria das áreas da química analítica, por exemplo, controle de qualidade, pesquisa fundamental e aplicada e controle governamental.

Os exemplos seguintes fornecem uma breve visão geral:

a) Farmácia

• Estudos farmacocinéticos de produtos farmacêuticos, por exemplo, processos de degradação de medicamentos
• Desenvolvimento de drogas, por exemplo Identificação de metabolitos ou identificação de impurezas

b) Biologia Molecular

• Proteómica, por exemplo, estudo em larga escala de proteínas, particularmente as suas estruturas e funções
• Metabolómica, por exemplo.por exemplo, determinação de intermediários metabólicos, hormonas e outras moléculas de sinalização

c) Ambiente

• Águas residuais, por exemplo Compostos endócrinos
• Solo, ex. organometálicos

d) Alimentos

• Ingredientes, ex. aminoácidos, lípidos
• Contaminantes, ex. Análise multi-resíduos de pesticidas, toxinas de frutos do mar, resíduos veterinários, determinação de corantes, acrilamida, análise de microcistina
• Produtos naturais, por exemplo terpens, esteróides

PFC (Perfluorinated tensides) como exemplo em análise de alimentos

Background

PFC é um excelente exemplo para combinar preparação de amostras complexas com sofisticados dispositivos LC/MS e um profundo conhecimento em química analítica. As propriedades únicas do PFT tornam-no útil numa gama de produtos industriais e comerciais, tais como fluidos refrigerantes, polímeros e como componentes em produtos farmacêuticos e pesticidas. Em particular, os carboxilatos perfluorados (por exemplo, PFOA – ácido perfluoro-octanóico) e os sulfonatos perfluorados (por exemplo, PFOS – ácido perfluorooctansulfónico) são utilizados como tensioactivos, por exemplo, para impregnar têxteis e tapetes, em espumas contra incêndios e para tratamentos de impermeabilização de gorduras na indústria do papel. O PFC é produzido há mais de 50 anos, e agora é distribuído em todo o mundo. Se as ligações C-H não forem totalmente substituídas por ligações C-F, uma das mais fortes ligações químicas conhecidas, a degradação ainda é possível.

Apenas PFOA e PFOS são avaliados toxicologicamente (tóxico crónico e cancerígeno), todos os outros compostos homólogos, isómeros, etc. ainda não são avaliados. Do ponto de vista físico, os PFC são persistentes (isto é, não degradáveis) e móveis (isto é, podem lixiviar de solos contaminados para as águas subterrâneas). Isto representa uma ameaça permanente no contexto da captação e/ou condicionamento de água potável. Além disso, as transferências de plantas introduzem estes compostos na cadeia alimentar.

As descobertas de altos níveis de contaminação por PFC em dois rios alemães em 2006 atraíram o interesse público para estes compostos.

A poluição de 2006 pode ter tido origem no lodo orgânico, aplicado como fertilizante para fins agrícolas. Foi demonstrado que o solo contém até 600 µg de PFC/kg, causando a contaminação da água potável e das plantas de abastecimento. Até o momento, sete estados federais alemães relataram contaminação por PFC.

Fraunhofer IME

Uma das principais competências do Instituto Fraunhofer de Biologia Molecular e Ecologia Aplicada é o desenvolvimento de métodos viáveis e confiáveis para a identificação e análise de contaminantes químicos em matrizes alimentares e ambientais.

Desde 1999, o Fraunhofer IME tem realizado projetos para medir a contaminação por PFC em várias matrizes ambientais. Este trabalho tem sido conduzido em nome de parceiros industriais e tem se concentrado particularmente nos carboxilatos de PFC e nos sulfonatos de PFC. Outras investigações foram realizadas em nome do Programa de Monitoramento do Banco Federal Alemão de Espécimes Ambientais, que também incluiu amostras de sangue humano. Em 2005, foram realizadas as primeiras investigações na área dos produtos alimentares e, em 2006, os resultados de amostras seleccionadas de alimentos (por exemplo, leite materno, batatas fritas) também foram discutidos nos meios de comunicação social. Em 2007, foram realizados projetos maiores focados na transferência de plantas, batatas e produtos, matrizes humanas (sangue e leite materno), bem como amostras ambientais (por exemplo, águas residuais, lodo e solo).

Solução analítica

Três preparações de amostras diferentes foram aplicadas para cobrir todas as matrizes de amostras possíveis:

• IPE (extração de par de íons). Uso do agente de emparelhamento iônico tetra-n-butilamônio hidrogenossulfato seguido por uma extração sólida líquida (por exemplo, amostras ambientais)
• AE (extração ácida alcalina). Remoção dos lípidos com hexano a pH 14 (solução líquida de amônia), ajuste a pH 1 com ácido clorídrico e extração com éter metílico terc-butil (por exemplo, leite materno)
• SPE (extração em fase sólida, atualmente o método mais citado) com cartuchos de polaridade diferente, dependendo do caráter iônico do PFC em um meio tamponado (por exemplo, amostras ambientais)
• AE (extração ácida alcalina).g. batata)

O uso de padrões internos para calibração é altamente recomendado; atualmente, nossos métodos incluem nove padrões de PFC com rótulo de massa. Antes de introduzir as amostras no LC/MS, o dispositivo em si tem que ser verificado para peças de reposição revestidas de Teflon, pois elas contêm PFC emissor que influenciará os resultados de forma não reprodutível. Essas peças devem ser substituídas, o que requer um conhecimento superior dos componentes LC/MS.

Exemplo analítico

Para as análises de batata crua e produtos de batata, ajustamos nossa LC/MS/MS (HPLC Alliance 2695 com Quattro Ultima Pt em modo Electrospray negativo, ambos Waters; 150 x 2 mm Luna 3 µm C18(2) coluna, Fenomenex) sistema para massas alvo de 9 ácidos perfluorocarboxílicos (C4 – C12) e 3 ácidos perfluorosulfónicos (C4, C6, C8) utilizando materiais de referência com 13C (LOQ 0.5 µg/Kg) após uma preparação de amostra SPE.

PFCs mostraram distribuição diferente em batata crua e em produtos de batata, (Tabela 1) o que permite supor uma contaminação durante o processamento, bem como a contaminação do solo. Isto pode ser apoiado pelas nossas investigações de 2006 com batatas fritas PFC, onde analisámos batatas fritas de restaurantes de comida rápida e encontrámos até 2,8 µg de PFOA/kg e até 0,9 µg de PFOS/kg.

>

Analytcal outlook

O Fraunhofer IME tem conhecimentos e experiência significativos na análise de PFC, que podem ser aplicados a muitas áreas de contaminação ambiental / alimentar com PFC que ainda não foram investigadas. Áreas importantes para futuras pesquisas de PFC podem incluir o aumento do número de analitos, muitos PFC de cadeia curta e longa já estão incluídos em nosso programa de estudos, mas nossa capacidade analítica poderia ser melhorada com a inclusão de PFC adicionais. O PFC adicional tem que ser identificado pela LC/MS porque os padrões comerciais não estão disponíveis. Isso levará a descobertas consolidadas dos precursores, das vias de contaminação e degradação dos alimentos durante o processamento dos alimentos.