DISCUSSÃO
Citrobacter é uma causa significativa de infecções oportunistas; C. diversus está associada a aproximadamente 40% dos casos apresentados, enquanto C. freundiirepresenta aproximadamente 29% (11). Citrobacterspp. causam meningite neonatal e têm uma propensão incomum para causar abscesso cerebral (8, 14). A patogênese deCitrobacter spp. causadora de meningite e abscesso cerebral não é bem caracterizada; entretanto, como ocorre com outras bactérias causadoras de meningite, a penetração da barreira hemato-encefálica deve ocorrer. O presente estudo foi realizado para compreender melhor as potenciais interacções deCitrobacter com a barreira hemato-encefálica. C. freundii foi escolhida como uma bactéria modelo para estes estudos porque a genética bacteriana é melhor definida e uma biblioteca genômica está disponível para eventuais estudos sobre a base molecular da invasão e replicação de C. citrobacter no HBMEC. Experimentos realizados com um isolado de líquido cefalorraquidiano de C. diversus produziram resultados similares (dados não mostrados), sugerindo que a frequência e o mecanismo da invasão do HBMEC para estas duas espécies podem ser semelhantes.
A barreira hematoencefálica é uma estrutura complexa que consiste do epitélio do plexo coróide e do endotélio capilar do cérebro. A presença de junções estreitas e baixa atividade pinocitótica para as células endoteliais resulta na restrição da passagem de macroelementos através da barreira hematoencefálica. Neste momento, não se sabe onde na barreira hemato-encefálica penetra C. freundii, mas o plexo coróide foi encontrado raramente envolvido no modelo de rato infantil de Citrobacter meningite hematogénica experimental (16). Além disso, células microvasculares endoteliais cobrem a maior área de superfície da barreira hematoencefálica, e outras bactérias causadoras de meningite mostraram invadir células endoteliais microvasculares in vitro (13, 20, 25). Por isso, nós selecionamos a HBMEC para o nosso estudo. Ensaios de invasão de cultura tecidual e estudos TEM forneceram evidências de que C. freundii invade o HBMEC. Os resultados dos ensaios de invasão realizados na presença de vários inibidores celulares eucarióticos sugerem que a invasão de C. freundii no HBMEC é um processo dependente de microfilamento, microtubular, de nova síntese protéica e acidificação endossômica. Os ensaios de invasão prolongada determinaram que C. freundii pode sobreviver e replicar intracelularmente por períodos prolongados in vitro. As análises TEM revelaram a localização intracelular de células de C. freundii individuais e múltiplas para estarem dentro de estruturas do tipo vacúolo de membrana única. Experiências da Transwell demonstraram que C. freundii poderia atravessar uma monocamada polarizada da HBMEC, enquanto que a E. coli não invasiva não poderia. Além disso, nossos dados preliminares mostram que C. freundii penetra a barreira hemato-encefálica no modelo neonatal de meningite hematogênica experimental de ratos (21). Em conjunto, estes achados sugerem que C. freundii invade vacúolos, possivelmente replicados, transcitoses através do HBMEC, é liberado no lado basolateral, e assim penetra na barreira hemato-encefálica.
Invasão de células eucarióticas por C. freundii tem sido relatada (22, 35). Entretanto, este é o primeiro relatório sobre a invasão do HBMEC por C. freundii. Curiosamente, os requisitos eucarióticos para a invasão de C. freundii são tão diversos quanto os tipos de células que C. freundii tem mostrado invadir. Por exemplo, o inibidor de fossa revestido de clatrina MDC mostrou-se inibir a invasão de C. freundii em todos os outros tipos celulares testados (por exemplo, células epiteliais vasculares, intestinais e vesicais humanas) exceto, como mostrado neste estudo, o HBMEC. Além disso, outras bactérias causadoras de meningite caracterizadas até agora entram no HBMEC em uma(s) via(s) dependente(s) de microtubulos e sensível(s) ao MDC (20, 24, 27). Os inibidores de fossa revestidos de clatrina MDC e ouabain não demonstraram inibir todos os receptores; assim, pode ser que o receptor necessário para a invasão de C. freundii do HBMEC não seja afetado pelo inibidor MDC ou ouabain. Embora evidências coletadas até agora sugiram que a entrada de C. freundii no HBMEC pode não ocorrer através de uma via mediada pelo receptor MDC ou ouabain sensível, parece que a acidificação endossômica e a síntese de nova proteína são ambas necessárias. Os dados disponíveis sugerem dois cenários possíveis. A acidificação do endossomo pode ser necessária como um desencadeador ambiental para a sobrevivência bacteriana intracelular. Requisitos semelhantes foram caracterizados para a invasão epitelial da Salmonella (26). Alternativamente, a acidificação do endossomo e a síntese de proteínas podem ser necessárias para a separação do complexo liga-receptor, síntese do receptor e/ou apresentação do receptor à superfície HBMEC para que ocorra a invasão de C. freundii. Este último cenário lembra outros patógenos invasivos, onde o contato do organismo viável é necessário para a modulação das moléculas de adesão de células eucarióticas que são necessárias para a invasão (por exemplo, Streptococcus pneumoniae e receptor de fator de ativação plaquetário) (2). Experimentos estão em andamento em nosso laboratório para distinguir entre estes cenários propostos.
Os ensaios de invasão realizados na presença de inibidores de microtubos (tanto despolimerizantes quanto estabilizantes) diminuíram significativamente a capacidade da HBMEC de tomar C. freundii. Experiências de microscopia confocal com anticorpos anti-α-tubulin mostrou que os microtubos agregados após o HBMEC entram em contato com C. freundii. A agregação dos microtubos foi um processo dependente do tempo; nenhuma agregação foi vista aos 5 min, pouco vista aos 15 min, e uma agregação nítida foi observada após 30 min de incubação de C. freundii com HBMEC. Esta agregação de microtubos foi inibida quando as células foram tratadas com inibidores de microtubos ou com agentes inibidores de microfiltração. De interesse, o padrão de coloração da agregação de microtubos não se colocava com ligação bacteriana e áreas de HBMEC que não mostravam ligação de C. freundii também demonstravam pronunciada aglomeração de microtubos. Isto sugere que o contato das bactérias com HBMEC pode estimular globalmente a agregação de microtubulos. Se a agregação dos microtubos é o resultado de um fator bacteriano secretado ou de uma resposta parácrina à ligação de bactérias ao HBMEC, ainda não se sabe se a agregação dos microtubos é o resultado de um fator bacteriano secretado ou de uma resposta parácrina à ligação de bactérias ao HBMEC. Além disso, a agregação de microtubulos em resposta à ligação de C. freundii pode estar relacionada à apresentação do receptor postulado via síntese de proteína nova e acidificação endossômica. Foi previamente demonstrado que o transporte de muitos receptores de e para a superfície celular é dependente de microtubos (10). Portanto, uma explicação para o efeito inibitório dos inibidores dos microtubos na entrada de C. freundii no HBMEC é que os agentes podem diminuir o número de receptores HBMEC que medeiam a C. freundiiinvasion. Experimentos estão em andamento para discernir entre estas possibilidades.
Microtubulos já mostraram anteriormente ser necessários para a invasão de muitos patógenos (por exemplo, Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, E. coli enteropatogênica e enterohemorrágica, e Campylobacter jejuni (4, 9, 22, 23, 29). O pensamento geral tem sido que embora estes patógenos possam entrar por vias dependentes de microtubos, geralmente não se replicam intracelularmente (6). Os dados adquiridos neste estudo a partir de ensaios de invasão prolongada e análise TEM sugerem que oC. freundii pode ser uma exceção a essa generalização. Ao contrário do que foi descrito para outra bactéria replicante intravacuole, Legionella pneumophila(12), não houve aparecimento de mitocôndrias ou ribossomos nas proximidades da bactéria. Isto sugere que C. freundii pode não usar estas organelas para obter energia diretamente ou que o recrutamento de proteínas específicas de células hospedeiras pode não ser necessário para sobrevivência e proliferação intracelular (como no caso de L. pneumophila). De particular relevância para infecções do sistema nervoso central, outras bactérias causadoras de meningite, tais como E. coli K1, GBS, e S. pneumoniae, demonstraram invadir (1, 13, 25) ou invadir e transcytose (20, 27) BMEC; entretanto, não foi constatado que os organismos se replicam dentro do HBMEC. Como descrito acima, a meningite por Citrobacter tem sido documentada por sua alta freqüência de formação de abscesso cerebral. Se a replicação dentro dos vacúolos do HBMEC é única para o Citrobacter e se há uma correlação com a formação de abscesso permanece por determinar.
Cytochalasin D inibe a invasão de C. freundii no HBMEC; entretanto, usando imunostaining, nós não encontramos nenhuma reorganização detectável dos microfilamentos quando C. freundii interagiu com o HBMEC (dados não mostrados). Além disso, o pré-tratamento com citocalsina D do HBMEC inibiu a agregação do microtubo dependente de bactérias, tal como visualizado por microscopia confocal. Pode haver várias explicações para estes resultados. O efeito da citocalsina D na agregação de microtubos dependente de bactérias pode ser devido aos efeitos indiretos do inibidor do microfilamento na rede de microtubos. Por exemplo, foram observados microtubulos que actuam como estruturas de ancoragem para a F-actin (28). Portanto, a ruptura da rede de microfilamentos pode afetar a rede de microtubos e, assim, afetar indiretamente a invasão do C. freundii, dependente do microtubo, do HBMEC. Alternativamente, um passo de invasão dependente de actina pode preceder um passo dependente de microtubo na invasão de C. freundii da HBMEC. Esta etapa inicial pode resultar na reorganização do microfilamento quando as bactérias estão inicialmente em contato com o HBMEC; entretanto, estes eventos podem ser transitórios e o desenho experimental utilizando microscopia de imunofluorescência pode não detectar adequadamente a sua ocorrência. Uma situação semelhante é observada para a invasão mediada por Yersiniainvasin (36). Portanto, se os estágios iniciais da invasão forem evitados pela citocassina D, os estágios subsequentes da invasão, que são dependentes do microtubular, não são desencadeados. Foi previamente demonstrado que a actina funciona na translocação dos factores proteicos ligados à actina para a membrana plasmática, bem como na sinalização citosólica (19). Além disso, a citochalasina D inibe a entrada de Salmonella através da perturbação da translocação das proteínas ligantes de actina para o local de entrada bacteriana (7). É possível que no caso da invasão de C. freundii do HBMEC, microfilamentos de actina sejam necessários para a sinalização citosólica e/ou penetração bacteriana na membrana plasmática, e microtúbulos podem ser necessários para o transporte de bactérias ligadas à membrana plasmática em direção ao lado basolateral (ou apenas mais profundamente dentro da célula). Assim, uma interrupção em qualquer estágio de invasão resultaria em um “engarrafamento”
Em resumo, os resultados aqui apresentados indicam que C. freundii pode invadir, multiplicar-se dentro e transcytose HBMEC in vitro. A determinação da base genética para estes fenótipos fornecerá uma visão significativa da fisiopatologia da Citrobactermeningite e potencialmente ajudará no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e preventivas. Além disso, uma extensa análise molecular comparativa do Citrobacter com outras bactérias causadoras de meningite pode lançar luz sobre a propriedade única do Citrobacter de formação de abscesso cerebral.