Abstract
A existência de células estaminais no líquido amniótico humano foi relatada pela primeira vez há quase dez anos. Desde esta descoberta, o conhecimento sobre estas células tem aumentado dramaticamente. Hoje, as células-tronco do líquido amniótico (AFS) são amplamente aceitas como uma nova e poderosa ferramenta para a pesquisa básica, bem como para o estabelecimento de novos conceitos de terapia baseada em células-tronco. É possível gerar linhas de células AFS genomicamente estáveis e monoclonais que abrigam um alto potencial proliferativo sem levantar questões éticas. Muitos grupos diferentes têm demonstrado que as células AFS podem ser diferenciadas em todas as três linhagens da camada germinal, o que é relevante para ambos, o uso científico e terapêutico destas células. De especial importância para esta última é o facto de as células de AFS serem menos tumorigénicas que outros tipos de células estaminais pluripotentes. Neste artigo, resumimos o conhecimento actual sobre este campo científico relativamente jovem. Além disso, discutimos as perspectivas futuras relevantes desta promissora área de pesquisa com células-tronco, focando as próximas questões importantes, que precisam ser respondidas.
1. Introdução
Embora as células do líquido amniótico humano sejam amplamente utilizadas no diagnóstico pré-natal de rotina, o conhecimento sobre estas células permanece limitado. No entanto, a noção de células indiferenciadas e diferenciadas de origens e linhagens variadas estão presentes no líquido amniótico tem sido apoiada por vários relatos ao longo das últimas três décadas. Isto não é surpreendente, considerando que células pertencentes ao epitélio amniótico, pele fetal e os sistemas urogenital, respiratório e gastrointestinal do feto foram detectadas no líquido amniótico. Durante a gestação prolongada, as secreções respiratórias fetais, urinárias e intestinais podem ser encontradas no líquido amniótico. Além disso, sabe-se também que a composição, a morfologia e as propriedades de crescimento de amostras de células de fluido amniótico são afetadas por certas patologias fetais, como por exemplo, defeitos no tubo neural ou gastrostercose .
Novo interesse em células derivadas do líquido amniótico foi iniciado por dois achados independentes. Em 2001, foi sugerido que células derivadas de fluido amniótico poderiam ser utilizadas em abordagens de engenharia de tecidos para a reparação cirúrgica de anomalias congênitas no período perinatal. Os autores isolaram mecanicamente uma subpopulação de células do líquido amniótico de ovelhas grávidas com uma morfologia distinta. O perfil imunocitoquímico destas células era muito comparável ao das células de uma linhagem mesenquimal, fibroblasto/miofibroblasto. Exibindo uma proliferação significativamente mais rápida do que células fetais e adultas comparáveis, estas células derivadas do líquido amniótico podiam ser cultivadas em andaimes de polímero de ácido poliglicólico até às camadas celulares confluentes. Foi originalmente discutido que tal construção seria ideal para funcionar como um enxerto para implantação no período neonatal ou mesmo antes do nascimento. Isso poderia ser de especial interesse para crianças nascidas com um defeito na parede do corpo, que são muito jovens para que um enxerto possa ser retirado de outro lugar em seus corpos para cirurgia reconstrutiva. Os resultados obtidos em modelos animais são realmente encorajadores. No entanto, tanto quanto sabemos, não temos conhecimento de um relatório que descreva o uso clínico de tal abordagem terapêutica baseada em células em humanos até agora.
Outra descoberta sobre células de líquido amniótico iniciou um campo de pesquisa muito promissor e em rápido crescimento. Quase dez anos atrás, foi publicada a primeira sugestão de fluido amniótico humano como uma nova fonte suposta para as células-tronco. A primeira evidência para a existência de células AFS foi demonstrada pela descoberta de um tipo de célula altamente proliferativa no fluido amniótico humano expressando o marcador pluripotente de células-tronco Oct4. Além do fato de que estas células expressam marcadores conhecidos por serem específicos para células-tronco pluripotentes, foi comprovado que elas expressam proteínas do ciclo celular conhecidas por serem específicas para células ciclóticas . Após esta primeira descrição, muitos grupos confirmaram a existência destas células Oct4+/c-Kit+ AFS e relataram seu potencial para se diferenciarem em hematopoiéticas, neurogênicas, osteogênicas, condrogênicas, adipogênicas, renais, hepáticas e várias outras linhagens . Embora, em relação às suas propriedades biológicas e padrão de expressão de marcadores, as células AFS parecem ser mais semelhantes às células estaminais embrionárias (Células ES) do que, por exemplo, às células trofoblasto, a origem precisa das células AFS permanece elusiva. Investigações bioquímicas, imunocitoquímicas, biológicas e morfológicas revelaram que as células AFS representam uma entidade nova e específica, sendo distintas das células ES ou outros tipos de células-tronco, como as que podem ser isoladas de fontes epiteliais amnióticas ou trofoblásticas. Hoje em dia, é de grande interesse esclarecer duas questões relevantes no que diz respeito às células AFS. De onde elas vêm? Elas têm uma função biológica in vivo? Já discutimos anteriormente que as células de AFS podem provavelmente desempenhar um papel nos processos de cicatrização intra-uterina da ferida. No entanto, até agora não existe apoio experimental para esta hipótese. É óbvio que os cenários experimentais que permitem provar esta hipótese não são realmente fáceis de imaginar ou práticos neste momento (ou ainda por desenvolver) .
Desde a sua primeira descoberta, foi da maior importância clarificar a questão de saber se as células AFS abrigam realmente um potencial de diferenciação pluripotente, iniciando com sucesso a diferenciação em diferentes linhagens a partir de uma única célula estaminal. É relevante notar que muitos relatórios diferentes na literatura que afirmam descrever pesquisas sobre células AFS não esclareceram sequer com que tipo de células elas estão trabalhando. Com bastante frequência, os investigadores apenas utilizaram uma mistura de células do líquido amniótico obtido através de procedimentos de cultivo específicos. Entretanto, como mencionado acima, tais misturas de células derivadas de fluido amniótico contêm uma grande variedade de tipos de células específicas indiferenciadas e diferenciadas. Sempre que um estudo relata um potencial de diferenciação em linhagens celulares específicas, é da maior relevância esclarecer primeiro qual tipo celular inicial foi utilizado (por caracterização biológica e imunocitoquímica detalhada). Além disso, a prova de que as células AFS realmente abrigam um potencial de diferenciação pluripotente só pode ser obtida a partir de uma única célula caracterizada como sendo uma célula-tronco. Em qualquer outro caso, pode-se supor que uma mistura de células do líquido amniótico, que tem sido usada como material inicial, muito provavelmente continha um tipo de célula com potencial de diferenciação em uma linhagem específica e outros tipos de células com outros potenciais de diferenciação. Ou o protocolo de diferenciação in vitro utilizado em alguns estudos induziu uma selecção (através de uma vantagem de crescimento) para um tipo de célula já (incluído) diferenciado, em vez da diferenciação bona fide. As abordagens de célula única são obrigatórias e práticas após experimentos de diluição mínima.
O primeiro grupo de pesquisa, que estava realmente levando isso em consideração, relatou que descendo de uma única célula AFS Oct4-positiva, foi possível induzir diferenciação adipogênica, osteogênica e neurogênica. Os autores utilizaram um protocolo de cultura em dois estágios seguido por uma caracterização imunocitoquímica detalhada do tipo de célula tronco obtida. Três anos depois, outro grupo de pesquisa isolou células AFS monoclonais via seleção citométrica de fluxo e diluição mínima, que expressou os marcadores de células-tronco c-Kit e Oct4 . Os autores descreveram o primeiro estabelecimento de linhas de células AFS monoclonais, abrigando um alto potencial proliferativo, que poderiam ser cultivadas por muitos períodos cíclicos com um status cromossômico estável. A utilização dessas linhas celulares de AFS permitiu-lhes demonstrar que a diferenciação celular adipogênica, osteogênica, miogênica, endotelial, neurogênica e hepática poderia ser induzida. Importante, esses autores também relataram que células AFS, ao contrário das células ES, não induzem a formação de tumores em ratos com imunodeficiência combinada grave (SCID) (para uma discussão detalhada desse aspecto veja abaixo) .
ES células, quando cultivadas na ausência de fatores de diferenciação, podem espontaneamente formar agregados multicelulares tridimensionais chamados corpos embrionários. No passado, os corpos embrionários têm sido amplamente considerados como um ponto de partida ideal para a diferenciação das células-tronco em várias linhagens. Assim, a formação de corpos embrionários seguida por diferentes abordagens indutoras de diferenciação é vista como uma forma adequada para provar o potencial de diferenciação pluripotente de um tipo específico de célula estaminal. Consequentemente, foi interessante testar se, partindo de uma única célula, as células AFS são capazes de formar corpos embrionários. De facto, as células humanas monoclonais de AFS podem formar corpos embrionários, quando cultivadas sem factores anti-diferenciação em condições em que são incapazes de se fixar à superfície dos pratos de cultura e sem contacto com as células de alimentação. A formação de tais agregados tridimensionais multicelulares é acompanhada por uma diminuição da expressão do marcador de células estaminais e pela indução da diferenciação em diferentes linhagens. Este estudo demonstrando o potencial de formar corpos embrionários foi a prova ultimativa de células AFS a serem pluripotentes. Além disso, permite agora a recapitulação e investigação das estruturas tridimensionais e contextos tecidulares de muitos fenómenos de diferenciação durante a embriogénese precoce de mamíferos. Estes achados sobre a pluripotência das células de AFS foram obtidos usando linhas de células monoclonais geradas através de separação de células magnéticas e abordagens de diluição mínima a partir de amostras de amniocentese humana. Hoje, existem muitas linhas monoclonais estabelecidas, que podem ser expandidas como células-tronco imaturas com alta taxa de proliferação em cultura sem a necessidade de células alimentadoras .
Junto, o estado atual do conhecimento é que as células AFS abrigam o potencial de se diferenciarem em tipos celulares das três camadas germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderme) e podem formar corpos embrionários, conhecido como o principal passo na diferenciação das células-tronco pluripotentes. Em comparação com outros tipos de células-tronco, como as células-tronco adultas, células ES, ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), as células AFS, têm vantagens específicas. As células-tronco adultas são frequentemente difíceis de amostrar, apresentam menor potencial de diferenciação do que as células AFS e não podem ser cultivadas com alta atividade proliferativa. A geração de linhas de células ES através da destruição de um embrião humano levanta uma variedade de questões éticas, que são discutidas de forma diferente de país para país. Além disso, as células ES são tumorigênicas, enquanto as células AFS, como já mencionado acima, não induzem a formação de tumores em ratos imunodeficientes combinados graves. Comparadas às células iPS, não há necessidade de indução ectópica de pluripotência nas células AFS. As células AFS são genomicamente estáveis e não abrigam a memória epigenética nem mutações somáticas de células de origem já diferenciadas. Além disso, células iPS têm sido relatadas para acumular anormalidades cariotípicas e mutações genéticas durante a propagação em cultura. Recentemente, tem sido relatado que durante a indução ectópica de pluripotência as células iPS recapitulam de forma incompleta o seu padrão epigenético. Esta importante descoberta deve ser levada em consideração quando estas células são planejadas para serem utilizadas em investigações detalhadas sobre processos de diferenciação, bem como quando são consideradas para novas abordagens terapêuticas putativas. As células AFS já apresentam propriedades de células estaminais e não necessitam de indução ectópica de pluripotência. Além disso, as células AFS já exibem o padrão epigenético das células-tronco. Em resumo, não é surpreendente que muitas tentativas estejam actualmente a concentrar-se na questão das condições em que as células AFS poderiam ser utilizadas para terapias baseadas em células estaminais. Além disso, as células AFS estão actualmente a tornar-se cada vez mais aceites como uma ferramenta ideal para a investigação básica .
Embora as células ES, iPS e AFS sejam consideradas como possuindo um potencial de diferenciação pluripotente, a questão de saber se elas exibem o mesmo espectro qualitativo de potencial de diferenciação permanece sem resposta. As células estaminais pluripotentes são definidas como células auto-replicáveis (as células podem dividir-se per se) conhecidas por terem a capacidade de se desenvolverem em células e tecidos das camadas germinativas primárias, ectoderme, mesoderme e endoderme. Estes três tipos de células estaminais (células ES, iPS e AFS) têm demonstrado o potencial de se diferenciarem em células das três camadas germinativas. Todas as três podem também formar corpos embrionários. No entanto, se eles realmente têm potenciais comparáveis para se diferenciarem em um tipo específico de célula com todas as suas funções biológicas conhecidas deve ser testado de caso para caso. De fato, acreditamos que é necessário examinar e comparar diretamente seus potenciais de diferenciação e selecionar os tipos celulares mais adequados para projetos científicos básicos e para o uso putativo em novas terapias baseadas em células-tronco. Além disso, uma diferença óbvia entre estes três tipos de células estaminais pluripotentes deve ser investigada com mais detalhes no futuro. Desde a primeira descrição do seu cultivo in vitro, sabe-se que as células estaminais são tumorigénicas. Da mesma forma, as células iPS induzem a formação de tumores, quando são transplantadas subcutâneamente em ratos nus. No entanto, células de SAF têm sido relatadas para não formar tumores em ratos imunodeficientes combinados graves. Uma vez que este último tem sido estudado até agora apenas em um projeto que analisa um conjunto específico de transplantes de animais, mais investigações são necessárias para esclarecer se as células de SAF não são realmente tumorigênicas. Obviamente, se for verdade, isto seria uma vantagem importante em relação às células de ES e iPS, pelo menos no que diz respeito a um uso clínico putativo .
2. Células de AFS para terapia: Perspectivas Futuras
Muita excitação em torno das células estaminais humanas está ligada à esperança dos clínicos e pacientes de que estas células possam uma vez ser usadas em terapias celulares para um amplo espectro de doenças humanas. Aqui deve ser dito claramente que o trabalho em terapias baseadas em células AFS está ainda na sua infância. Muitas questões estão actualmente em investigação, e até agora nenhuma abordagem terapêutica baseada em células AFS atingiu o nível de aplicação clínica de rotina. No entanto, uma variedade de novos resultados de pesquisa fornece fortes evidências de que as células AFS poderiam de fato servir como uma poderosa ferramenta na medicina regenerativa .
Por exemplo, as insuficiências renais agudas e crônicas são doenças com altas taxas de morbidade e mortalidade. O transplante renal continua sendo a opção de tratamento mais eficaz para a maioria dos pacientes com doença renal em fase terminal. Infelizmente, a escassez de órgãos compatíveis é um fator muito limitante. As estratégias de tratamento também são baseadas na diálise renal convencional, mas a taxa de mortalidade dos pacientes que requerem diálise crônica é alta. Assim, o uso putativo de células estaminais na reparação de lesões renais foi o foco da atenção. Vários estudos recentemente publicados sobre a diferenciação renal das células AFS tornam tentador especular que estas células estaminais poderiam ser consideradas uma vez como uma nova fonte promissora para terapias baseadas em células para reparar lesões renais e justificam mais investigações nesta direcção. Utilizando um ensaio de reagregação renal, publicamos recentemente que as células de AFS têm o potencial de se diferenciarem das linhagens nefrogénicas e que esta capacidade depende da via de sinalização do alvo mamífero da rapamicina (mTOR) (ver também a discussão abaixo). Outros demonstraram que células de AFS humana podem se integrar em tecidos renais quando injetadas em rins embrionários murinos isolados ou que a injeção de células de AFS em rins danificados de camundongos com necrose tubular aguda relacionada à rabdomiólise pode mediar um efeito protetor. Embora estes e outros dados tornem tentador especular que as células AFS podem fornecer abordagens alternativas bem sucedidas para o tratamento, por exemplo, da necrose tubular aguda, muitas outras questões devem ser respondidas antes que tais terapias baseadas em células possam ser consideradas para aplicações de rotina em humanos.
Por muitas razões diferentes, o estabelecimento de novas terapias baseadas em células-tronco para patologias até então incuráveis do sistema nervoso central, como a doença de Parkinson, lesão medular, esclerose múltipla ou acidente vascular cerebral, também é de grande interesse. As células estaminais neurais, que foram investigadas para este fim, podem ser encontradas no sistema nervoso central do adulto e no embrião em desenvolvimento, mas estes tecidos não estão facilmente disponíveis e levantam preocupações éticas. Nos últimos anos, diferentes grupos têm relatado o potencial de diferenciação neurogênica das células da SAF. Entretanto, antes que os próximos passos na direção do uso clínico de abordagens baseadas em células AFS possam ser considerados, a prova de que a AFS realmente pode formar neurônios maduros deve ser fornecida. Na verdade, ainda há um debate contínuo na literatura, discutindo se as células com SFA são realmente capazes de formar neurônios funcionais. Num futuro próximo, será muito importante descobrir que tipo de células neurogênicas podem ser desenvolvidas a partir de células AFS. A questão se as células AFS podem se diferenciar em neurônios funcionais maduros deve ser investigada através da análise da capacidade de disparar potenciais de ação sensíveis à tetrodotoxina com a forma e duração características ou através da demonstração de comunicação sináptica por microscopia eletrônica .
Aqui, seria possível discutir mais alguns exemplos de abordagens terapêuticas putativas usando células AFS. Algumas vezes, argumenta-se que muitas questões básicas sobre a origem, aigenicidade tumoral, o potencial de diferenciação, o estado epigenético ou a estabilidade genômica devem ser investigadas antes que as células da SAF possam ser consideradas como uma ferramenta terapêutica. Contudo, acreditamos que todos estes aspectos devem ser estudados em paralelo. Além disso, para considerações futuras é realmente importante comparar quantitativa e qualitativamente todas estas propriedades das células AFS com aquelas de outros tipos de células-tronco pluripotentes ou adultas.
3. Células AFS na Ciência Básica: Perspectivas Futuras
Células-tronco são ferramentas muito úteis para estudar a regulação molecular e celular dos processos de diferenciação. Uma abordagem para aprender mais sobre o papel de, por exemplo, um gene específico para um determinado processo de diferenciação é derrubar a expressão endógena do gene de interesse. Tal abordagem permite esclarecer o papel da expressão gênica modulada para que o potencial celular se diferencie em uma linhagem específica. Publicamos recentemente um protocolo para o silenciamento eficiente do gene prolongado mediado pelo siRNA nas células AFS . Este protocolo, que já testamos para uma variedade de genes diferentes, permite uma diminuição de 96-98% na expressão do gene endógeno durante um período de cerca de 14 dias em células AFS e em uma variedade de outras células primárias, imortalizadas ou transformadas .
Mais recentemente, fizemos uso desta abordagem para estudar o papel da via mTOR em células AFS humanas. A desregulação dos reguladores a montante do mTOR, como, por exemplo, Wnt, Ras, TNF-α, PI3K ou Akt, é uma marca registrada em muitos cancros humanos. Mutações nos genes componentes da via do mTOR TSC1, TSC2, LKB1, PTEN, VHL, NF1 e PKD1 desencadeiam o desenvolvimento das síndromes genéticas humanas: esclerose tuberosa, a síndrome de Peutz-Jeghers, a síndrome de Cowden, a síndrome de Bannayan-Riley-Ruvalcaba, a doença de Lhermitte-Duclos, a síndrome de Proteus, a doença de von Hippel-Lindau, a neurofibromatose tipo 1, e a doença renal policística. Além de uma variedade de desordens unogenéticas e tumorigenese, a via mTOR também se mostrou relevante para o desenvolvimento de doenças complexas, tais como hipertrofia cardíaca, obesidade ou diabetes tipo 2. Todas estas consequências patológicas da atividade desregulada da mTOR são explicáveis, considerando que a mTOR é o componente chave da cascata de sinalização da insulina, que está envolvida em uma grande variedade de diferentes processos, tais como crescimento celular, proliferação, metabolismo, transcrição, tradução, sobrevivência, autofagia, envelhecimento, diferenciação e oncogênese. Verificamos que todo o processo de formação do corpo embrionário de células AFS depende de enzimas que contêm mTOR, mTORC1 e mTORC2 . Como mencionado acima, a modulação dos componentes da mTOR através de abordagens específicas de siRNA revelou que o potencial das células de AFS para contribuir para a formação de tecido renal é regulado por esta via de sinalização . Mais recentemente, a abordagem das funções do gene endógeno de knock-down nas células AFS permitiu-nos detectar que os dois reguladores mTOR, a tuberina e o PRAS40, são anti-apoptóticos durante a diferenciação celular precoce da AFS humana . Em conjunto, acreditamos firmemente que a abordagem de derrubar a expressão do gene endógeno em linhas de células de AFS humanas monoclonais é uma ferramenta muito poderosa para futuros projetos que lidem com a regulação molecular da diferenciação .
Outro aspecto muito interessante para futuras pesquisas básicas é o banco de linhas de células de AFS portadoras de mutações naturais, que são relevantes para certos fenótipos patológicos humanos. Na genética médica, o desenvolvimento futuro de novas estratégias profiláticas e terapêuticas depende diretamente de uma melhor compreensão dos mecanismos pelos quais a variação genética que ocorre naturalmente contribui para a doença. Nos países onde é legal utilizar embriões humanos para a investigação, as linhas de células ES portadoras de certos defeitos hereditários são geradas a partir de embriões com todo o tipo de anomalias cromossómicas numéricas ou mutações específicas de doenças monogénicas excluídas da transferência para o útero após o diagnóstico genético pré-implantatório. Também já foram geradas várias linhas de iPS a partir de doenças unogenéticas, síndromes cromossômicas e doenças complexas, com o objetivo de utilizá-las em projetos de pesquisa básica . Ainda assim, como já discutido em detalhe, tanto as células ES como as células iPS apresentam desvantagens relevantes em comparação com as células AFS. Além de outras abordagens invasivas, a amniocentese é um procedimento padrão amplamente aceito nos cuidados pré-natais desde os anos 70. É quase imprevisível quantas amniocentese são realizadas por ano em todo o mundo. Em conjunto, acreditamos que a geração e o armazenamento de linhas de células normais de AFS humana e de linhas de células AFS com aberrações cromossômicas, bem como de linhas de células AFS com mutações específicas de doenças monogênicas, poderiam fornecer ferramentas muito poderosas para a modelagem de doenças em pesquisas futuras. Aqui é importante notar que o banco de células AFS para fins não de investigação, com o objectivo de proteger a saúde de uma criança, tendo células estaminais disponíveis durante toda a sua vida, é algo mais. Algumas empresas na Europa e nos EUA já estão oferecendo o banco de células AFS, quando, por exemplo, é realizada uma amniocentese para diagnóstico pré-natal. Os seus argumentos para a preservação das células AFS são que estas células poderiam ajudar a tratar lesões (por exemplo, a reparação da cartilagem do joelho), cicatrizar feridas ou desenvolver pele para enxertos específicos. Como mencionado anteriormente, no futuro, é necessária uma extensa pesquisa para estabelecer o uso clínico putativo das células estaminais AFS em humanos. Os resultados promissores obtidos durante os últimos anos neste ainda jovem campo científico justificam claramente mais investigações detalhadas sobre a direcção de uma suposta aplicação clínica das células AFS. Neste artigo gostaríamos de enfatizar que o armazenamento de células AFS com mutações naturais para pesquisa genética humana deveria ter começado o mais rápido possível em diferentes laboratórios sob padrões comparáveis de alta qualidade. Valeria a pena encorajar diferentes laboratórios a amostrar líquido amniótico de amniocentese com indicações comparáveis de semanas de gravidez semelhantes. Os protocolos para isolar células-tronco, realizar diluições mínimas e caracterizar as linhas de células AFS monoclonais tão obesas devem ser padronizados. O biobanking das linhas de células AFS com mutações caracterizadas permitiria saltar para o próximo passo da pesquisa genética humana usando células-tronco humanas.