Back to Basics – What is an Immunoassay – Downloadable PDF Version
What is an immunoassay or ELISA?
Immunoassays are quick and accurate tests that can be used on-site and in the laboratory to detect specific molecules. Os imunoensaios dependem da capacidade inerente de um anticorpo para se ligar à estrutura específica de uma molécula. Os anticorpos são proteínas geradas pelos animais em resposta à invasão de uma molécula estranha (antigénio) no corpo. Os anticorpos são encontrados no sangue e nos fluidos dos tecidos e ligam-se ao antígeno sempre que este é encontrado. Como os anticorpos são desenvolvidos para a estrutura tridimensional específica de um antígeno, ou analito, eles são altamente específicos e se ligarão apenas a essa estrutura. Uma vez purificados a partir do sangue, os anticorpos monoclonais e policlonais são reagentes de ensaio ideais para detectar e monitorizar moléculas alvo específicas com interferências limitadas de outras substâncias. Quatro formatos típicos do ELISA são: imunoensaios de anticorpos em sanduíche, imunoensaios antigen-down, ensaios de inibição competitiva e ensaios rápidos.
Imunoensaio de anticorpos em sanduíche
Num imunoensaio típico de anticorpos em sanduíche, um anticorpo monoclonal é adsorvido numa placa de microtitulação plástica. Quando a amostra é adicionada à placa, o anticorpo da placa ligará o antigénio alvo da amostra e retê-lo-á na placa. Quando um anticorpo policlonal é adicionado no passo seguinte, também se liga ao antigénio alvo (já ligado ao anticorpo monoclonal da placa), formando assim uma “sanduíche” de antigénio entre os dois anticorpos diferentes.
– Passo 1: Os anticorpos monoclonais são adsorvidos no poço de uma placa de microtitulação de plástico com tampão de revestimento (sem adição de amostra).
– Passo 2: Adição de uma amostra (como sangue humano, diluído apropriadamente) ao poço da placa de microtitulação. O antigénio alvo liga-se ao anticorpo adsorvido na placa, mantendo o antigénio no poço.
– Passo 3: Ligação de um anticorpo policlonal conjugado com enzimas ao antigénio alvo (ligado ao anticorpo monoclonal na placa), formando assim uma “sanduíche” de antigénio entre os dois anticorpos diferentes.
– Passo 4: A adição de um substrato colorimétrico para detecção dos anticorpos policlonais conjugados com enzimas irá gerar um sinal de cor proporcional à quantidade de antigénio alvo presente na amostra original adicionada à placa.
Antigen-Down (Teste de Imunidade) Imunoensaio
Num imunoensaio com antigénio para baixo (teste de imunidade), o analito é revestido para ligar os anticorpos encontrados numa amostra. Quando a amostra é adicionada (como soro humano), o antigénio na placa é ligado por anticorpos (IgE por exemplo) da amostra, que são depois retidos no poço. A seguir é adicionado um anticorpo específico da espécie (IgE anti-humano, por exemplo) rotulado com HRP, que se liga ao anticorpo ligado ao antigénio na placa. Quanto maior for o sinal, mais anticorpos existem na amostra. Os ensaios Antigen-down (teste de imunidade) podem ser configurados como testes rápidos e são frequentemente utilizados para diagnosticar condições de alergia – o sangue de um doente é testado rotineiramente contra diferentes alergénios para ver se a pessoa tem anticorpos para esse alergénio.
Imunoensaio de inibição competitiva
Além do formato de sanduíche de anticorpos Monoclonal-Policlonal (Mo-Po), muitos imunoensaios são estruturados num formato de inibição competitiva. Os ensaios de inibição competitiva são frequentemente utilizados para medir analitos pequenos porque os ensaios de inibição competitiva requerem apenas a ligação de um anticorpo em vez de dois, como nos formatos padrão ELISA. Devido à alta probabilidade de ocorrência de obstáculos estéreis quando dois anticorpos tentam ligar-se a uma pequena molécula ao mesmo tempo, um formato de ensaio em sanduíche pode não ser viável. Portanto, um ensaio de inibição competitiva seria preferível.
Num ensaio de inibição competitiva sequencial, a amostra e o analito conjugado são adicionados em etapas como um ensaio em sanduíche, enquanto num ensaio clássico de inibição competitiva, estes reagentes são incubados juntos ao mesmo tempo. Em um ensaio de inibição competitiva sequencial, um anticorpo monoclonal é revestido em uma placa de microtitulação de 96 poços. Quando a amostra é adicionada, o MoAb captura o analito livre da amostra. No passo seguinte, uma quantidade conhecida de analito rotulado com biotina ou HRP é adicionada. A substância a analisar rotulada também tentará ligar-se ao MoAb adsorvido na placa, contudo, a substância a analisar rotulada é inibida de ligar-se ao MoAb pela presença de substância a analisar previamente ligada a partir da amostra. Isto significa que o analito rotulado não será ligado pelo monoclonal na placa se o monoclonal já tiver ligado o analito não rotulado da amostra. A quantidade de substância a analisar não rotulada na amostra é inversamente proporcional ao sinal gerado pela substância a analisar rotulada. Quanto menor o sinal, mais analito não rotulado existe na amostra. Uma curva padrão pode ser construída usando diluições em série de um padrão de substância a ser analisada não rotulado. Os valores de amostra subsequentes podem então ser lidos fora da curva padrão como é feito nos formatos ELISA em sanduíche. O clássico formato de ensaio de inibição competitiva requer a adição simultânea de analito rotulado (analito conjugado) e analito não rotulado (a partir da amostra). Tanto a substância a analisar rotulada como a não rotulada competem simultaneamente pelo local de ligação no anticorpo de captura monoclonal na placa. Tal como o formato sequencial de inibição competitiva, o sinal colorido é inversamente proporcional à concentração da substância a analisar sem marcação na amostra. A detecção do analito rotulado pode ser feita utilizando um substrato de peroxidase, como a TMB, que pode ser lido num leitor de placas de microtitulação.
Imunoensaio Rápido
Além das placas de microtitulação, os imunoensaios também são configurados como testes rápidos, como um teste de gravidez caseiro. Tal como os ensaios de placas de microtitulação, os testes rápidos usam anticorpos para reagir com antigénios e podem ser desenvolvidos como formatos de sanduíche MoAb-PoAb, formatos de inibição competitivos, e formatos de antígeno para baixo. Com um teste rápido, os anticorpos e reagentes antigénicos são ligados a membranas porosas, que reagem com amostras positivas enquanto canalizam o excesso de fluidos para uma parte não reactiva da membrana. Os imunoensaios rápidos geralmente vêm em 2 configurações: um teste de fluxo lateral onde a amostra é simplesmente colocada em um poço e os resultados são lidos imediatamente; e um sistema de fluxo através do qual é necessário colocar a amostra em um poço, lavando o poço, e finalmente adicionar um conjugado de ouro analito coloidal e o resultado é lido após alguns minutos. Uma amostra é testada por tira ou cassete. Como os testes rápidos são mais rápidos que os ensaios com microplacas, requerem pouco processamento de amostras, são muitas vezes mais baratos e geram respostas de sim/não sem o uso de um instrumento, muitas vezes são usados no campo por pessoas não-laboratoriais testando amostras inteiras. Contudo, os imunoensaios rápidos não são tão sensíveis nem podem ser utilizados para quantificar com precisão um analito (o auto-monitoramento dos níveis de glicemia por diabéticos é considerado um teste rápido quantitativo, contudo, a tecnologia de imunoensaios não é utilizada para estes testes). Todos os testes de imunoensaio rápido podem ser convertidos para um ensaio de microtitulação em placas, mas nem todos os ensaios de microtitulação em placas podem ser convertidos para um teste rápido.
