Around 1000 a.C. uma onda de imigrantes estabeleceu-se no vale superior do Tibre até ao Mar Adriático, e também nos arredores de Assis. Estes eram os Umbrianos, vivendo em pequenos povoados fortificados em terras altas. A partir de 450 a.C., estes povoados foram gradualmente tomados pelos Etruscos. Os romanos assumiram o controle da Itália central após a Batalha de Sentinum, em 295 aC. Eles construíram o florescente município de Asisium em uma série de terraços no Monte Subasio. Restos romanos ainda podem ser encontrados em Assis: muralhas da cidade, o fórum (agora Piazza del Comune), um teatro, um anfiteatro e o Templo de Minerva (agora transformado na Igreja de Santa Maria sopra Minerva). Em 1997, os restos de uma villa romana foram também descobertos contendo várias salas bem conservadas com frescos e mosaicos em condições raramente encontradas fora de locais como Pompei.
Em 238 AD Assis foi convertida ao cristianismo pelo bispo Rufino, que foi martirizado em Costano. Segundo a tradição, seus restos mortais repousam na Igreja Catedral de San Rufino em Assis.
Os ostrogodos do rei Totila destruíram a maior parte da cidade em 545. Assis então ficou sob o domínio dos Lombardos como parte do Lombard e depois Frankish Duchy de Spoleto.
A próspera comuna tornou-se uma comuna Ghibelline independente no século XI. Lutando constantemente contra o Guelph Perugia, foi durante uma dessas batalhas, a batalha na Ponte San Giovanni, que Francesco di Bernardone (São Francisco de Assis) foi feito prisioneiro, pondo em marcha os acontecimentos que o levaram a viver como mendigo, renunciar ao mundo e estabelecer a Ordem dos Frades Menores.
A cidade, que tinha permanecido dentro dos limites das muralhas romanas, começou a expandir-se para fora destas muralhas no século XIII. Neste período, a cidade estava sob jurisdição papal. A Rocca Maggiore, a fortaleza imperial no topo da colina acima da cidade, que tinha sido saqueada pelo povo em 1189, foi reconstruída em 1367 por ordem do legado papal, o cardeal Gil de Albornoz.
No início, Assis caiu sob o domínio de Perugia e mais tarde sob vários déspotas, como o soldado da fortuna Biordo Michelotti, Gian Galeazzo Visconti e o seu sucessor Francesco I Sforza, duques de Milão, Jacopo Piccinino e Federico II da Montefeltro, senhor de Urbino. A cidade entrou num profundo declínio através da peste da Peste Negra em 1348.
A cidade voltou a estar sob jurisdição papal sob o governo do Papa Pio II (1458-1464).
Em 1569 iniciou-se a construção da Basílica de Santa Maria degli Angeli. Durante o Renascimento e em séculos posteriores, a cidade continuou a desenvolver-se pacificamente, como atestam os palazzi do século XVII dos Bernabei e Giacobetti.
Agora o local de muitas peregrinações, Assis está ligada em lenda ao seu filho nativo, São Francisco. A gentil santa fundou a ordem franciscana e divide as honras com Santa Catarina de Sena como a padroeira da Itália. Ele é lembrado por muitos, mesmo não-cristãos, como um amante da natureza (sua pregação a um público de aves é uma das lendas de sua vida).
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Assis foi atingida por dois terremotos devastadores, que sacudiram a Úmbria em setembro de 1997. Mas a recuperação e restauração foram notáveis, embora ainda haja muito a ser feito. Muitos locais históricos sofreram danos maciços, mas a maior atração, a Basílica de São Francisco, reabriu menos de 2 anos depois.