Abstract
Objectivo. Para esclarecer o efeito do Lactobacillus plantarum 299v no cortisol salivar e nos níveis de IgA salivar em adultos jovens sob exame de estresse. Desenho. Quarenta e um alunos com um próximo exame acadêmico foram incluídos em um estudo randomizado duplo-cego, controlado por placebo. As bactérias probióticas ou o produto placebo foram administrados em cápsulas uma vez por dia durante 14 dias. A saliva foi coletada e um teste de estresse percebido foi preenchido em cada ocasião de amostragem. A saliva foi colhida para análise do cortisol por Electrochemiluminescência Imunoensaio (ECLI) e a IgA salivar foi analisada por Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). A abundância de lactobacilos foi avaliada pelo cultivo de saliva em meio selectivo e a identificação de L. plantarum 299v foi feita em colónias seleccionadas aleatoriamente através de uma amplificação aleatória da tipagem de ADN polimórfico (RAPD). Resultados. Uma diferença significativa nos níveis de cortisol foi encontrada entre o grupo de tratamento e o grupo placebo (), juntamente com um aumento significativo nos níveis de lactobacilos no grupo de tratamento em comparação com o grupo placebo (). Não foram encontradas alterações significativas para a IgA salivar. Conclusão. Uma bactéria probiótica com capacidade para reduzir os sintomas da síndrome do cólon irritável (SII) proibiu o aumento dos níveis do cortisol marcador de estresse durante o período de exame. O número de registro do estudo é NCT02974894, e o estudo está registrado em ClinicalTrials.gov.
1. Introdução
Há uma ligação entre o aparelho digestivo e o stress fisiológico e o cortisol salivar e a imunoglobulina salivar A (IgA salivar) pode ser tomada como marcadores de stress . O cortisol é uma hormona esteróide libertada pelas supra-renais em resposta ao stress e os níveis aumentados têm estado relacionados com a supressão do sistema imunitário . A IgA salivar é parte da defesa imunológica oral e o anticorpo mais abundante na saliva, predominantemente na forma de IgA secretora . Glândulas salivares menores, posicionadas em toda a mucosa oral, secretam cerca de 30-35% de todas as IgA salivares que ocorrem na saliva inteira do adulto .
Probióticos são definidos como “microorganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas conferem um benefício de saúde ao hospedeiro” . L. plantarum 299v mostrou em estudos anteriores um efeito positivo nos sintomas da síndrome do intestino irritável (SII), tais como inchaço e dor . Esta estirpe também demonstrou neutralizar o vazamento intestinal que, por sua vez, poderia atenuar a resposta do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) ao estresse . Não foram realizados estudos anteriores sobre o efeito do L. plantarum 299v em condições relacionadas ao estresse. Entretanto, foi demonstrado em filhotes de rato estressados pela separação de suas mães que uma mistura probiótica de Lactobacillus rhamnosus R0011 e Lactobacillus helveticus R0052 diminuiu significativamente os níveis de corticosterona, a analogia do cortisol no sangue dos animais . Também, ratos submetidos a um stressor agudo limitado no tempo ficaram menos stressados após o tratamento com Lactobacillus farciminis , juntamente com a diminuição dos níveis de lipopolissacarídeos (LPS) no sangue .
Não se sabe muito sobre os efeitos das bactérias probióticas nos marcadores de stress na saliva, apesar da saliva ser um método fácil e não invasivo que não causa qualquer dano ou desconforto à pessoa de teste. Isto é particularmente importante quando se avalia os marcadores de stress onde um aumento agudo pode ser devido ao método de amostragem e não ao agente de stress agudo avaliado no estudo. Quando se trata de efeitos probióticos nos níveis de IgA salivares, a maioria dos estudos está relacionada à incidência de várias infecções respiratórias e, em um estudo anterior, foi relatado que os níveis secretos de IgA nas fezes aumentaram em um grupo de crianças recebendo um produto contendo L. rhamnosus HN001 em comparação com um grupo placebo. Resultados semelhantes foram obtidos com a estirpe L. rhamnosus GG .
O estresse crônico está relacionado ao aumento dos níveis de cortisol, mas se o cortisol é um agente causador das reações fisiológicas de estresse ou apenas uma conseqüência dele está aberto para discussão . A liberação de cortisol é uma resposta periférica retardada a um estresse agudo e sugere-se que o cortisol exerça tanto ações estimuladoras quanto supressoras na resposta ao estresse do corpo. Um exemplo de ação estimulante é o desencadeamento da ativação cardiovascular; no entanto, em resposta, por exemplo, a um fator de estresse hemorrágico, o cortisol está suprimindo a resposta de volume de fluido diminuído, inibindo a secreção rápida inicial de hormônios vasoconstritores do estresse. Quanto às propriedades imuno-reguladoras do cortisol, a sua secreção é sugerida para proteger contra o “excesso” da resposta imunológica que de outra forma aconteceria em resposta ao estresse . No entanto, ainda não está claro para que serve o aumento do nível de cortisol durante a resposta do organismo ao estresse .
No presente estudo o objetivo principal foi esclarecer o efeito da bactéria probiótica Lactobacillus plantarum 299v no nível de cortisol salivar em adultos jovens sob exame de estresse. A IgA salivar de glândulas menores e em toda a saliva humana foi medida como marcadores alternativos de stress. A hipótese era que os níveis de cortisol seriam reduzidos ou estabilizados no grupo teste, em comparação com o grupo placebo, onde se esperava que os níveis de cortisol aumentassem devido ao estresse induzido pelo exame. Em contraste, os níveis de IgA salivares deveriam aumentar no grupo teste, em comparação com o grupo placebo.
2. Materiais e Métodos
2,1. Desenho do estudo
No presente ensaio aleatório, duplo-cego controlado por placebo, estudantes voluntários da Universidade de Lund, na idade entre 18 e 30 anos, participaram durante o período do exame. Os critérios de exclusão foram gravidez, bem como a ingestão de antibióticos e medicação temporária com cortisona durante o período do estudo. Foi realizado um cálculo de potência para decidir a quantidade de sujeitos e 40 indivíduos foram considerados suficientes. 42 adultos jovens saudáveis foram voluntários para o estudo, 28 mulheres e 14 homens, e todos os participantes deram seu consentimento livre e esclarecido assinado para o estudo. Após uma desistência masculina, 41 indivíduos completaram todo o período experimental. 21 receberam o produto teste numa dose diária de 1 1010 unidades formadoras de colónias de L. plantarum 299v em cápsulas (L. plantarum 299v, amido de batata, hidroxipropil metilcelulose e estearato de magnésio, (Probi AB, Lund, Suécia)) e 20 receberam cápsulas de placebo, contendo os mesmos ingredientes que o produto teste, com excepção das bactérias. Antes de iniciar o período experimental, houve um período de washout de duas semanas quando os participantes foram instruídos a evitar a ingestão de produtos probióticos. A ingestão da cápsula ocorreu depois disso uma vez por dia após o almoço e os sujeitos foram convidados a não comer, beber, fumar ou tomar rapé durante uma hora após a ingestão. Os participantes também foram instruídos a mastigar a cápsula até que o pó fosse dissolvido na boca (mínimo 30 seg) ou esvaziar a cápsula em uma colher e mastigar o pó por 30 seg antes de ingerir. As amostras de referência para todos os participantes foram coletadas no dia 0, antes de qualquer ingestão do produto. O estudo continuou por 14 dias e a data de início foi decidida individualmente para todos os participantes, num período de 1,5 semanas.
2,2. Avaliação psicológica
Foi incluída uma avaliação psicológica para que os sujeitos do teste pudessem avaliar o seu stress auto-percebido. Um questionário com 30 questões desenvolvido por Levenstein et al. foi utilizado e a pontuação mais baixa obtida indica um menor grau de estresse e vice-versa. Um índice com um número entre 0 e 1 foi calculado usando o seguinte:
2,3. Amostragem de saliva
Saliva da glândula menor foi colhida nas áreas da mucosa labial inferior como descrito anteriormente e a saliva inteira foi colhida no mesmo dia da amostragem. Para reduzir a influência das variações circadianas na secreção de saliva durante a coleta, todas as amostragens foram feitas entre 15 e 17 horas. Todas as amostras foram coletadas nos dias 0 e 14, e, nos dias 5 e 10, apenas amostras de cortisol foram coletadas. Os participantes foram instruídos a não comer, beber, tomar rapé, fumar, escovar os dentes ou fazer qualquer tipo de exercício uma hora antes da coleta. O álcool também foi proibido doze horas antes da hora da coleta de amostras.
2,4. Análise de Cortisol
Amostras de saliva para a análise de cortisol foi realizada com uma Salivette® para cortisol (Sarstedt, Alemanha) e foi feita após a coleta de saliva para análise de IgA. Os participantes foram instruídos a fazer circular o pântano na boca durante 2-5 minutos, até que fosse preenchido com saliva e depois cuspido cuidadosamente para dentro do tubo. Os tubos foram colocados em gelo e posteriormente congelados a -20°C até a análise. A análise do cortisol foi realizada pela Labmedicin Skåne (os laboratórios universitários e regionais da Região de Skåne, Suécia) e foi realizada de acordo com a acreditação. O método utilizado foi um ensaio de competição de uma etapa com a técnica de detecção Electrochemiluminescência Imunoensaio (ECLI) baseado no derivado de ruténio (Ru) .
2.5. Análise de IgA salivar
Saliva da glândula menor foi recolhida do lábio inferior por uma tira SialoPaper® (Oraflow Inc., Nova Iorque, EUA) e suavemente colocada sobre a mucosa durante 60 s e o volume salivar dentro da tira foi medido por um Periotron® 8000 (Oraflow Inc., Nova Iorque, EUA). A tira SialoPaper foi colocada em 1 mL de PBS (1,5 mL PP, Sarstedt, Alemanha; Fosfato Salino Tampão, Dulbecco A, Oxoid, Inglaterra) sobre gelo e armazenada a -80°C até a análise. A saliva inteira não estimulada foi coletada após a amostragem da saliva de glândulas menores. Os participantes sentaram-se, inclinados ligeiramente para a frente, e deixaram a saliva escorrer para um microtubo de 2 mL com a ajuda de uma palha estéril (1 mL de pipetas descartáveis estéreis, Kemikalia, Suécia; 2 mL de PP, Sarstedt, Alemanha). Todas as amostras foram armazenadas a -80°C até a análise.
A concentração de IgA secretada na saliva é relativa à quantidade total de proteína e portanto a unidade % IgA/total de proteína é escolhida para representar o resultado de toda a análise da saliva. Isto é relevante uma vez que a secreção de IgA muda com a taxa de fluxo salivar, que por sua vez muda com estímulos no sistema nervoso autônomo, por exemplo, estresse agudo, estresse crônico e repouso. Esta alteração na taxa de fluxo é explicada pela medição da % de IgA/total de proteína na saliva, o que o torna um método preciso ao comparar dados de diferentes sujeitos de teste .
Para analisar a concentração de IgA salivar, foi realizada uma análise de sandwich-ELISA modificada de acordo com Krzywkowski et al. , usando α1- e α2-chain-specific goat anti-humano IgA (5 μg/mL, Sigma I0884; Sigma Chemical Co., St Louis, MO, EUA) conjugado com fosfatase alcalina (Sigma A9669; diluído 1 : 30.000 em PBST). A concentração proteica total foi analisada por um ensaio de proteína de início rápido (BIO-RAD) .
A IgA salivar na saliva da glândula menor foi expressa em mg/100 mL. A análise de IgA salivar foi realizada na Faculdade de Odontologia da Universidade de Malmö (Malmö, Suécia).
2.6. Contagem de Lactobacilos em Placa
Para analisar os lactobacilos orais os sujeitos de teste mastigados em uma pastilha de parafina (Orion Diagnostics) para estimular a secreção de saliva, e a coleta foi feita da mesma forma que para a IgA salivar na saliva inteira. A coleta desta amostra de saliva foi feita no final de cada amostragem, uma vez que este método de amostragem dá uma saliva fortemente estimulada, ao contrário dos outros métodos. Os tubos foram colocados em gelo e 0,25 mL da amostra de saliva foi transferida para outro microtubo estéril (1,5 mL PP, Sarstedt, Alemanha) que continha 0,5 mL de meio de congelamento. Ambos os tubos foram salvos em -80°C até a análise.
Abundância de lactobacilos foi avaliada por contagem de placas. As amostras foram diluídas e espalhadas em placas de ágar Rogosa (Oxoid, Inglaterra) e as placas foram incubadas a 37°C por 72 horas sob condições anaeróbicas (2,5 L, AnaeroGen™, Oxoid). Duas colônias de cada placa foram colhidas aleatoriamente e recultivadas. Os isolados foram congelados e armazenados em meios de congelamento a -80°C.
2.7. Identificação de L. plantarum 299v
Para extração de DNA de cada isolado as amostras foram descongeladas e vortexadas pouco antes da adição de 1 mL de água MilliQ estéril e centrifugação na velocidade máxima (14 800 g, 1 min). O sobrenadante foi removido e mais 0,25 mL de água MilliQ estéril foi adicionada. O extracto celular restante foi triturado suavemente com contas de vidro estéreis Assistent® (Ø 2 mm, Glaswarenfabrik Karl Hecht, Alemanha) num agitador (6°C, 30 min) e todas as amostras foram então utilizadas numa amplificação aleatória da reacção de ADN polimórfico (RAPD), para estudar a ocorrência de L. plantarum 299v. Mastermix para 35 amostras incluindo 175 μL tampão (Qiagen, Alemanha), 35 μL dNTP (Roche Diagnostics, Alemanha), 35 μL Primer 73 (Qiagen, Alemanha), e 8,75 μL Taq-Polimerase (Qiagen, Alemanha) foi preparada. 7,25 μL da mastermix foi adicionado a cada tubo PCR (Gene Amp 0,5 mL, Applied Biosystems, Singapura) juntamente com 42,75 μL de H2O e 1 μL do sobrenadante das amostras.
A reacção RAPD foi realizada numa máquina PCR (Perkin Elmer, DNA Thermal Cycler, EUA) de acordo com Quednau et al. . Os géis para a electroforese em gel foram preparados adicionando 0,75 g de Agarose DNA Grade Electran® (VWR, Bélgica) a 50 mL de tampão TB; depois a solução foi aquecida até ferver e vertida em tanques de gel para arrefecer. Os géis foram finalmente colocados em tabuleiros de gel com tampão de TB. 2-5 μL de cada amostra foi adicionado em cada poço juntamente com 3 μL de tampão de carga antes de executar a electroforese (100 V, 1 h). Gel Redx3 (Biotium Inc., USA), 1 mL em 99 mL dH2O, foi utilizado durante 20 min para colorir os géis e as fotos foram tiradas de acordo com Quednau et al. .
2.8. Cálculos estatísticos
Os dados foram avaliados estatisticamente usando uma Análise de Variância Unidirecional Kruskal-Wallis (ANOVA) em Ranks ou um teste Mann-Whitney Ranks Sum quando apropriado. A – teste foi usado para comparação em pares das concentrações absolutas de IgA, bem como dos níveis absolutos de cortisol. As ferramentas estatísticas foram Sigma Plot (11,0 e 12,0) e Excel 2013. Além disso, um teste de incidência relativo à ocorrência de L. plantarum 299v foi realizado com o teste Fisher Exact, usando o QuickStat (2.6). Os dados foram apresentados como mediana e intervalo interquartil, assim como média e desvio padrão. Os valores mínimo e máximo para as amostras de cortisol foram eliminados para remover o impacto de outliers, uma vez que um claro desvio podia ser visto nos dados. Isto só dizia respeito às amostras de cortisol. Os valores pertencentes aos participantes que não preenchiam todos os requisitos do estudo foram controlados e não foram encontrados desvios. Seus resultados foram, portanto, incluídos.
2,9. Permissão Ética
O estudo foi aprovado pelo Conselho Regional de Ética em Lund (Ref 2013/166) e as considerações éticas incluíram os benefícios e riscos com o produto utilizado e a possibilidade de relações pessoais já existentes entre o pessoal responsável pelo teste e os indivíduos que realizaram o estudo.
3. Resultados
3,1. Avaliação da Avaliação Psicológica
A avaliação psicológica não mostrou diferença significativa de estresse percebido entre os grupos e, adicionalmente, não houve diferença significativa dentro de cada grupo ao comparar os diferentes dias de amostragem.
3,2. Os níveis de cortisol absoluto (nM) no dia de referência (dia 0) foram 9,18 (±2,50) para o grupo placebo e 9,47 (±2,96) para o grupo teste, não havendo diferença significativa entre os dois grupos (). Quando a mudança relativa nos níveis medianos de cortisol foi comparada a um valor de referência no dia 0 (linha de base), foi encontrada uma diferença significativa entre os grupos no dia 10 (; Figura 1). Não foi encontrada significância dentro dos grupos.
Figura 1
A diferença nos valores medianos de cortisol (nM) comparados aos valores de referência (dia 0). Asterisco () denota uma diferença significativa () em relação ao grupo placebo no dia 10.
3.3. Concentrações de IgA na saliva
Os níveis absolutos de IgA (mg/100 mL) na saliva da glândula menor no dia de referência (dia 0) foram de 1,99 (±3,76) para o grupo placebo e 4,80 (±9,17) para o grupo teste, sem diferença significativa entre os dois grupos (). Os níveis absolutos de IgA (% IgA/total de proteína) na saliva total no dia de referência (dia 0) foram 25,3 (±7,37) para o grupo placebo e 27,1 (±12,2) para o grupo teste, sem diferença significativa entre os dois grupos (). Em contraste com as mudanças nos níveis de cortisol, as concentrações médias de IgA salivares na saliva total ou saliva das glândulas menores não foram afetadas pelo consumo probiótico; ou seja, não foi mostrada diferença significativa entre o grupo probiótico e o grupo placebo (Figuras 2 e 3, resp.).
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3.4. Contagem viável de Lactobacilos e Identificação de L. plantarum 299v
No dia 14 houve um aumento significativo na abundância de lactobacilos na saliva dos sujeitos de teste que consomem probióticos em comparação com aqueles dados do produto placebo (). O aumento também foi significativo () dentro do grupo probiótico quando se comparou a linha de base com o dia da amostragem final (, Figura 4). A incidência de isolados identificados como L. plantarum 299v foi significativamente aumentada no dia 14 em pessoas com níveis detectáveis de lactobacilos, tanto quando comparados com o grupo placebo como com a linha de base ().
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4. Discussão
A maioria dos participantes teve seu exame antes do final do estudo, resultando em um aparente, mas não significativo (), pico de estresse percebido no dia 10 para o grupo placebo. Isto coincide com o pico de concentração de cortisol salivar no grupo placebo no 10º dia (Figura 1). Em contraste, não foi observado nenhum pico no grupo probiótico, sugerindo que o consumo probiótico teve um efeito sobre o estresse visto como a secreção de cortisol das adrenais. No dia 14, muitos dos voluntários tinham terminado seus exames e, portanto, uma diminuição do cortisol poderia ser esperada, já que o cortisol responde relativamente rápido aos estressores agudos.
Academic stress, aqui na forma de um período de exame, não pode ser considerado como estresse crônico, já que os participantes podem ver um fim do período estressante. Sugere-se, portanto, que o stress académico é mais semelhante ao stress agudo no que diz respeito à resposta ao stress. Os níveis de cortisol do presente estudo estavam na mesma faixa do que foi relatado anteriormente para o estresse agudo .
O estresse crônico está relacionado a um aumento sustentado da secreção de cortisol. Debate-se recentemente se é o aumento real dos níveis de cortisol ou como os tecidos-alvo respondem ao aumento dos níveis que é a causa de muitas doenças e sintomas associados ao estresse crônico. O que é conhecido é que um aumento prolongado dos níveis de glicose no sangue pode levar ao desperdício muscular, acumulação de gordura, redistribuição e possível diabetes. Assim, um possível alvo para os probióticos poderia ser indivíduos cronicamente estressados, onde os níveis elevados sustentados de cortisol aumentam seu risco de desenvolver doenças ligadas ao estresse crônico .
Existem geralmente grandes diferenças individuais nos níveis medidos de IgA salivares, que confundem as tentativas de ver diferenças entre pequenos grupos de indivíduos. Entretanto, os valores medianos nos diferentes grupos correspondem bem àqueles relatados por outros. Os resultados presentes de todas as amostras de saliva mostraram que os valores entre placebo e grupo de teste não diferiram significativamente um do outro e que os valores medianos em ambos os grupos foram semelhantes. Observando a mudança relativa em cada grupo, o valor mediano foi ligeiramente positivo para o grupo probiótico, enquanto que foi ligeiramente negativo no grupo placebo. Comparando com os percentis 25 e 75, observa-se um aumento em grande parte dos níveis de IgA salivares detectados no grupo placebo, o que torna difícil tirar quaisquer conclusões (Figura 2). Os estressores que causam stress crónico têm estado ligados à diminuição dos níveis de IgA salivares, enquanto que o stress agudo tem mostrado aumentar os níveis, o que indica uma activação da resposta imunitária. Portanto, poderia ser sugerido que o fator de estresse neste estudo é mais provável que seja agudo do que crônico.
Estudos anteriores mostraram uma tendência sugerindo que os probióticos podem aumentar os níveis de IgA salivar durante o estresse . No entanto, as pessoas do presente estudo só tiveram uma ingestão de probióticos durante um período de duas semanas, e mesmo que houvesse um nível significativamente mais alto de lactobacilos neste grupo, poderia ser que o período do estudo fosse muito curto para ver mudanças claras em um nível individual. Devido às grandes diferenças individuais nos níveis de IgA salivares, um aumento do número de participantes em cada grupo também teria sido desejável.
Os níveis de IgA salivares na saliva da glândula menor são mais altos do que os relatados por outros, o que poderia ser devido a diferenças individuais ou devido ao desenho do estudo deste trabalho. Por exemplo, um certo nível e tipo de estresse foi aplicado aos participantes, o que não foi aplicado no estudo feito por Sonesson et al. . Os dados da saliva da glândula menor mostraram que os valores medianos foram maiores no grupo teste do que no grupo placebo, mas a diferença entre os grupos não foi significativa. O aumento parece ser maior no grupo dado aos probióticos em relação ao grupo placebo, mas a mudança relativa no valor da mediana é aproximadamente a mesma nos dois grupos. Entretanto, as barras de erro indicam grandes variações dentro do grupo dado aos probióticos, o que pode explicar a contradição (Figura 3).
Encorajamento naturalista, incluindo o estresse acadêmico, é esperado que esteja em algum lugar entre o estresse agudo e crônico em relação ao aumento ou diminuição dos marcadores de estresse. Como o stressor é difícil de definir em relação ao tipo de stress que é aplicado e como o stress individual aplicado a cada participante pode ter sido diferente, as diferenças insignificantes encontradas estão em linha com a teoria de como o IgA pode reflectir o stress. Poderia ter sido mais fácil observar mudanças no IgA salivar se o período de estudo tivesse sido mais longo, ou se amostras adicionais tivessem sido coletadas uma ou duas semanas após o estudo, uma vez que os níveis de IgA foram vistos a diminuir também algum tempo após o estresse experimentado em outros estudos. Outra explicação poderia ser que, embora os participantes tenham sido aconselhados a anotar quaisquer alterações no seu estado de saúde (por exemplo, incidentes de frio), isto não foi controlado para, nem comparado com outliers nos dados de IgA salivares. Os resfriados e outras infecções respiratórias provavelmente causariam um aumento na IgA salivar, já que a IgA é parte da primeira linha de defesa do sistema imunológico contra patógenos.
Houve um aumento significativo nos níveis de lactobacilos para o grupo probiótico, também em comparação com o grupo placebo, mostrando que as bactérias administradas poderiam sobreviver na cavidade oral (Figura 4). Isto também foi apoiado pelo resultado da tipagem RAPD, indicando a ocorrência de L. plantarum 299v nas amostras onde os níveis de lactobacilos estavam acima do limite de detecção. Assim, parece haver uma ligação entre o aumento da presença das bactérias probióticas e a diminuição dos níveis de cortisol na saliva.
5. Conclusões
Existe uma diferença significativa na resposta de secreção de cortisol entre as pessoas testadas que receberam probióticos ou placebo, possivelmente em relação ao estresse. Além disso, observou-se um aumento significativo nos níveis de lactobacilos para o grupo probiótico, em comparação com o grupo placebo. Em contraste, não foi encontrada significância para IgA salivar.
Interesses Concorrentes
Irini Lazou Ahrén é um empregado da Probi AB. O produto e as cápsulas de placebo foram fornecidos pela Probi AB. Nenhum outro interesse concorrente deve ser relatado.
Contribuições dos autores
Os dois primeiros autores, Hannah Andersson e Cecilia Tullberg, contribuíram igualmente para este trabalho e a primeira autoria é compartilhada.
Conhecimento
Os autores agradecem a Jie Xu e Marie Kala, da Universidade de Lund, pela ajuda do laboratório.