Stein spędziła niemowlęctwo w Wiedniu i w Passy we Francji, a dziewczęctwo w Oakland w Kalifornii. Wstąpiła do Society for the Collegiate Instruction of Women (przemianowanego na Radcliffe College w 1894 roku), gdzie studiowała psychologię u filozofa Williama Jamesa i otrzymała dyplom w 1898 roku. W latach 1897-1902 studiowała w Johns Hopkins Medical School, a następnie, wraz ze starszym bratem Leo, przeniosła się najpierw do Londynu, a potem do Paryża, gdzie mogła żyć z prywatnych środków. Mieszkała z Leo, który stał się znakomitym krytykiem sztuki, do 1909 roku; potem mieszkała ze swoją towarzyszką życia, Alice B. Toklas (1877-1967).
Stein i jej brat byli jednymi z pierwszych kolekcjonerów dzieł kubistów i innych eksperymentalnych malarzy tego okresu, takich jak Pablo Picasso (który namalował jej portret), Henri Matisse i Georges Braque, z których kilku zostało jej przyjaciółmi. W jej salonie spotykali się z emigracyjnymi pisarzami amerykańskimi, których nazwała „straconym pokoleniem”, w tym Sherwoodem Andersonem i Ernestem Hemingwayem, oraz innymi gośćmi przyciągniętymi przez jej literacką reputację. Jej literackie i artystyczne osądy były czczone, a jej przypadkowe uwagi mogły uczynić lub zniszczyć reputację.
W swojej własnej twórczości próbowała paralelizować teorie kubizmu, szczególnie w jej koncentracji na oświetleniu chwili obecnej (dla której często opierała się na czasie present perfect) i jej użyciu lekko zróżnicowanych powtórzeń i ekstremalnych uproszczeń i fragmentacji. Najlepszym wyjaśnieniem jej teorii pisania jest esej Composition as Explanation, oparty na wykładach prowadzonych przez nią na uniwersytetach w Oxfordzie i Cambridge, wydany w formie książkowej w 1926 roku. Wśród jej prac, na które kubizm wywarł największy wpływ, znajduje się obraz Tender Buttons (1914), w którym fragmentaryzacja i abstrakcja zostały doprowadzone do skrajności.
Jej pierwsza opublikowana książka, Three Lives (1909), historie trzech kobiet z klasy robotniczej, została nazwana małym arcydziełem. The Making of Americans, długi utwór napisany w latach 1906-11, ale nie opublikowany do 1925 roku, był zbyt zagmatwany i niejasny dla ogółu czytelników, dla których pozostała zasadniczo autorką takich wierszy jak „Róża jest różą jest różą jest różą”. Jedyną jej książką, która trafiła do szerokiej publiczności, była Autobiografia Alice B. Toklas (1933), właściwie autobiografia samej Stein. Wystawienie w Stanach Zjednoczonych jej Czterech świętych w trzech aktach (1934), które kompozytor Virgil Thomson przerobił na operę, doprowadziło do triumfalnego amerykańskiego tournée z wykładami w latach 1934-35. Thomson napisał również muzykę do jej drugiej opery, The Mother of Us All (wyd. 1947), opartej na życiu feministki Susan B. Anthony. Jedno z wczesnych opowiadań Stein, „Q.E.D.”, zostało po raz pierwszy opublikowane w Things as They Are (1950).
Ekscentryczna Stein nie była skromna w swojej samoocenie: „Einstein był twórczym umysłem filozoficznym stulecia, a ja byłam twórczym umysłem literackim stulecia”. Stała się legendą w Paryżu, zwłaszcza po przeżyciu niemieckiej okupacji Francji i zaprzyjaźnieniu się z wieloma młodymi amerykańskimi wojskowymi, którzy ją odwiedzali. Napisała o tych żołnierzach w Brewsie i Willie (1946).