Trial design
W tym randomizowanym, podwójnie zaślepionym, kontrolowanym placebo badaniu, zdrowi ochotnicy z nadwagą i lekką otyłością zostaną przydzieleni do jednej z trzech grup magnezowych lub grupy kontrolnej placebo. Badanie zostanie przeprowadzone w Uniwersyteckim Centrum Medycznym w Groningen (UMCG). Obecny protokół został napisany zgodnie z wytycznymi Standard Protocol Items: Recommendations for Interventional Trials (SPIRIT) (ryc. 1 i plik dodatkowy 1). Zatwierdzenie komitetu etycznego uzyskano z UMCG, Holandia.
Schemat zapisów, interwencji i oceny. PWVc-f prędkość fali tętna od tętnicy szyjnej do udowej, PHQ-15 Kwestionariusz Zdrowia Pacjenta
Charakterystyka uczestników
Do niniejszego badania kwalifikują się wyłącznie osoby, które wyrażą pisemną świadomą zgodę. Ponadto uczestnicy powinni być w wieku od 45 do 75 lat i mieć nadwagę lub lekką otyłość (wskaźnik masy ciała między 25 a 35 kg/m2), ponieważ oczekuje się, że ci uczestnicy będą mieli zwiększoną sztywność tętnic i ciśnienie krwi na linii podstawowej, co pozwoli na poprawę w wyniku interwencji. Aby uniknąć ewentualnych różnic w wynikach badania spowodowanych efektami hormonalnymi, do badania zostaną włączone wyłącznie kobiety po menopauzie (≥ 2 lata od ostatniej miesiączki). Do badania nie kwalifikują się uczestniczki spełniające którekolwiek z poniższych kryteriów:
-
wysokie spożycie magnezu (definiowane jako wydalanie magnezu z moczem ≥ 7,0 lub ≥ 5.9 mmol/24 h, odpowiednio dla mężczyzn i kobiet);
-
glukoza w osoczu ≥ 7,0 mmol/l;
-
cholesterol całkowity w surowicy ≥ 8,0 mmol/l;
-
trójglicerydy w surowicy ≥ 2.2 mmol/l;
-
obecny palacz lub zaprzestanie palenia < 12 miesięcy;
-
obecność cukrzycy;
-
rodzinna hipercholesterolemia;
-
nadużywanie narkotyków;
-
więcej niż 21 spożyć alkoholu tygodniowo;
-
niestabilna masa ciała (zwiększenie lub zmniejszenie masy ciała > 3 kg w ciągu ostatnich 3 miesięcy);
-
stosowanie inhibitorów pompy protonowej;
-
stosowanie leków obniżających stężenie lipidów i (lub) leków przeciwnadciśnieniowych, które rozpoczęto w ciągu ostatnich 6 miesięcy;
-
stosowanie suplementów magnezu lub badanego produktu w ramach innej biomedycyny w ciągu ostatniego 1 miesiąca;
-
ciężkie stany chorobowe, które mogą zakłócać przebieg badania, takie jak padaczka, astma, niewydolność nerek lub niewydolność nerek, przewlekła obturacyjna choroba płuc, zapalne choroby jelit, choroby autozapalne i reumatoidalne zapalenie stawów;
-
aktywna choroba sercowo-naczyniowa; lub
-
niechęć do rezygnacji z bycia dawcą krwi (lub oddawania krwi) od 8 tygodni przed rozpoczęciem badania i podczas badania.
Interwencje
Uczestnicy z nadwagą i lekką otyłością zostaną losowo przydzieleni do otrzymywania: cytrynianu magnezu; tlenku magnezu; siarczanu magnezu; lub placebo. Schemat przebiegu interwencji w badaniu przedstawiono na ryc. 2. Uczestnicy badania będą proszeni o przyjmowanie 2 kapsułek trzy razy dziennie przez 24 tygodnie. W dni testowe pierwsze 2 kapsułki będą przyjmowane po zakończeniu wszystkich pomiarów. Każdy suplement magnezu dostarcza 75 mg magnezu (Magnesium Citrate Complex (Mg 15,5%) Magnesium Sulphate Complex (17,4%) i Magnesium Oxide Complex (60,3%); AMT Laboratories Inc.) W ten sposób dzienne spożycie magnezu w 6 kapsułkach wyniesie 450 mg. Kapsułki placebo będą zawierały skrobię (Amylum solani). Całkowity czas trwania leczenia wynoszący 24 tygodnie jest oparty na naszym poprzednim badaniu, które wykazało znaczący wpływ suplementacji magnezu na sztywność tętnic po 24 tygodniach. Na linii podstawowej i w tygodniach 2, 12 i 24 uczestnicy przejdą PWVc-f, biurowe pomiary ciśnienia krwi i składu ciała. Przed każdym dniem badania, uczestnicy będą zbierać 24-godzinne próbki moczu i kału. Ponadto uczestnicy zostaną poproszeni o wypełnienie Kwestionariusza Zdrowia Pacjenta (PHQ-15) przed każdym dniem badania. PHQ-15 jest podskalą objawów somatycznych pochodzącą z pełnego PHQ. Kwestionariusz ten obejmuje około 15 objawów somatycznych lub grup objawów, które stanowią ponad 90% dolegliwości fizycznych zgłaszanych w warunkach ambulatoryjnych. Wreszcie, uczestnicy będą zapisywać w dzienniczkach wszelkie objawy choroby, jak również stosowane leki i wszelkie odstępstwa od protokołu podczas badania. Uczestników badania prosi się o niezmienianie poziomu aktywności fizycznej, schematu przyjmowania pokarmów i spożywania alkoholu podczas całego badania.
Schemat blokowy projektu badania
Śledzenie i randomizacja
Aby zapewnić podwójnie ślepą próbę, optycznie podobne kapsułki będą pakowane i kodowane przez laboratorium Medisan (Heerenveen, Holandia), które dostarczy leki stosowane w badaniu (suplementy magnezu i placebo). Ponadto, laboratorium to przeprowadzi procedurę randomizacji. W tym celu stworzy listę kategorialną w porządku logicznym. Lista ta będzie zawierała jedną interwencję dla każdego uczestnika. W oparciu o wygenerowaną komputerowo listę liczb losowych, badani będą randomizowani do jednej z grup. W ten sposób powstanie randomizowana lista przydziału leczenia.
Obliczenie wielkości próby
Bieżące badanie jest zasilane na sztywność tętnic, pierwszorzędowy punkt końcowy. Wymagana wielkość próby do badania noninferiority została obliczona w oparciu o margines 0,5 m/s, prawdopodobieństwo 0,05 i moc 0,80. Dlatego potrzeba 41 uczestników na grupę magnezu. Aby porównać cytrynian magnezu z placebo, zakładamy, że liczba uczestników na grupę obliczona dla próby dwuramiennej (n = 24) jest wystarczająca. Ponieważ spodziewany jest 10% wskaźnik rezygnacji, do rozpoczęcia badania zrekrutowanych zostanie 162 uczestników. Biorąc pod uwagę, że tylko 50% uczestników badania przesiewowego spełni wszystkie kryteria włączenia i będzie skłonnych do udziału w badaniu, oczekuje się, że w wizytach przesiewowych weźmie udział 324 uczestników.
Ta kalkulacja wielkości próby opiera się na zmienności wewnątrzprzedmiotowej 0,9 m/s i zmianie PWVc-f o 1,0 m/s po 24 tygodniach suplementacji magnezem stwierdzonej w naszym poprzednim badaniu. Margines równoważności wynoszący 0,5 m/s jest oparty na obserwowanym efekcie, który wynosi 50% efektu suplementacji cytrynianem magnezu w porównaniu z placebo. Do obliczenia wielkości próby zastosowano wzór Juliousa.
Zgodność z interwencją
Zgodność będzie oceniana na podstawie liczby zwróconych kapsułek po 12 i 24 tygodniach. Uczestnicy badania będą uważani za przestrzegających zaleceń, jeśli przyjmą co najmniej 80% kapsułek. Dodatkowo, będziemy oceniać zgodność na podstawie stężenia magnezu w moczu pod koniec badania.
Główny wynik
PWVc-f będzie rejestrowana w dwóch egzemplarzach przy użyciu urządzenia SphygmoCor v9 (AtCor Medical, West Ryde, Australia). Najpierw zostanie zmierzona odległość od wcięcia nadmostkowego do udowego miejsca rejestracji (przez pępek). Następnie odejmuje się odległość od wcięcia nadmostkowego do miejsca rejestracji tętnicy szyjnej (po prawej stronie). Dodatkowo zostanie zmierzona bezpośrednia odległość pomiędzy miejscem rejestracji tętnicy szyjnej a miejscem rejestracji tętnicy udowej (prawej). W drugiej kolejności przyłożone zostaną elektrody EKG w celu identyfikacji załamka R w zespole EKG. Następnie, przy użyciu tonometru, na tętnicy szyjnej i udowej mierzone będzie nadejście fali tętna i opóźnienie w stosunku do fali R w EKG. Jeśli wszystkie prawidłowe pomiary zostaną wprowadzone i zapisane, program producenta automatycznie obliczy PWVc-f. Za pomocą tego samego tonometru przyłożonego do tętnicy promieniowej w okolicy nadgarstka prawego ramienia zostanie wyznaczona analiza fali tętna (PWA). Pomiary są zsynchronizowane beat to beat i będą rejestrowane w dwóch egzemplarzach. Na podstawie tych zapisów program producenta automatycznie określi centralny wskaźnik augmentacji skorygowany o częstość akcji serca (CAIxHR75).
Wyniki drugorzędowe
Ciśnienie krwi
Ciśnienie krwi (skurczowe i rozkurczowe) oraz częstość akcji serca będą monitorowane za pomocą urządzenia do ciągłego monitorowania ciśnienia krwi (Criticare 506 N3; Criticare Systems Inc., Waukesha, WI, USA). Badacz będzie mierzył ciśnienie krwi przed pomiarami PWVc-f. Po okresie aklimatyzacji, trwającym co najmniej 15 min, w pozycji leżącej na plecach, dokonywany będzie pomiar ciśnienia tętniczego w warunkach biurowych. Pierwszy pomiar zostanie odrzucony, a średnia z trzech ostatnich pomiarów zostanie podana .
Mikrobiota jelitowa
Badani zostaną poproszeni o pobranie próbki kału 1 lub 2 dni przed dniem badania i przechowywanie próbki w lodówce w domu. Zostaną poproszeni o przyniesienie próbki do UMCG na lodzie (elementy chłodzące lub w woreczku z kostkami lodu). W dniu badania próbki będą natychmiast przechowywane w temperaturze – 80 °C. Będziemy badać różnorodność mikrobiomu, specyficzną taksonomię operacyjną, jak również specyficzne krążące metabolity, w tym fenyloacetyloglutaminę, tlenek trimetyloaminy (TMAO) i indolproprionian (IPA), które zostały wcześniej powiązane odpowiednio ze zdarzeniami sercowo-naczyniowymi i zespołem metabolicznym. Skład mikrobioty jelitowej w próbkach kału będzie analizowany za pomocą amplifikacji PCR zmiennego regionu 16S rRNA V4-V5 i głębokiego sekwencjonowania przy użyciu platformy Illumina® MiSeq.
Pomiary antropometryczne
W każdym dniu badania, pomiary antropometryczne (masa ciała bez butów i ciężkiej odzieży oraz skład ciała) będą wykonywane w celu scharakteryzowania uczestników. Skład ciała (np. masa tłuszczu, beztłuszczowa masa ciała, woda pozakomórkowa i woda wewnątrzkomórkowa) będzie mierzony za pomocą analizy impedancji bioelektrycznej (Bodystat Quadscan 4000®; Quadscan, Douglas, Isle of Man, UK). Pomiary będą przeprowadzane z pacjentem w pozycji leżącej na wznak przez 5 minut, z rękami równolegle do tułowia i oddzielonymi od niego, z nogami rozstawionymi na boki. Miejsca elektrod zostaną oczyszczone za pomocą chusteczki z alkoholem. Dwie elektrody zostaną umieszczone na prawej dłoni i nadgarstku, a kolejne dwie na prawej stopie i kostce.
Kwestionariusz Zdrowia Pacjenta
Uczestnicy zostaną poproszeni o wypełnienie Kwestionariusza Zdrowia Pacjenta (PHQ-15) przed każdym dniem badania. PHQ-15 jest podskalą objawów somatycznych pochodzącą z pełnego PHQ. Kwestionariusz ten obejmuje około 15 objawów somatycznych lub grup objawów, które stanowią ponad 90% dolegliwości fizycznych zgłaszanych w warunkach ambulatoryjnych.
Chemia kliniczna
Próbki krwi będą analizowane w Zakładzie Medycyny Laboratoryjnej UMCG, zgodnie z rutynowymi procedurami: osoczowy poziom magnezu, sodu, potasu, chlorków, wapnia, fosforanów, mocznika, białka całkowitego, albumin, kreatyniny oraz hemoglobiny, hematokrytu, leukocytów, trombocytów i markerów ryzyka metabolicznego (trójglicerydy, cholesterol całkowity, LDL-cholesterol i HDL-cholesterol, glukoza w osoczu na czczo i HbA1C). Ponadto oznaczane będą stężenia wapnia, sodu, potasu, chlorków i kreatyniny w moczu. W celu określenia statusu magnezu, poziomy magnezu w osoczu i magnezu w erytrocytach będą mierzone zgodnie z rutynowymi procedurami.
Dietetyczne spożycie
Aby upewnić się, że uczestnicy zachowali swój wzorzec żywieniowy podczas badania, uczestnicy są proszeni o zgłaszanie swojej diety przez 3 kolejne dni na początku i na końcu badania w dzienniczkach żywieniowych przy użyciu standardowych jednostek podaży. Dzienniczki te zostaną sprawdzone pod kątem kompletności przez badacza.
Analiza statystyczna
Dla parametrów o rozkładzie normalnym dane zostaną przedstawione jako wartość średnia i odchylenie standardowe. Parametry o rozkładzie nienormalnym będą przedstawiane jako mediana (zakres). Dla analiz statystycznych odpowiedzi będą obliczane jako różnica między wartościami obserwacyjnymi i wyjściowymi. W przypadku analiz pierwotnych, w których oceniany będzie wpływ cytrynianu magnezu na sztywność tętnic, testowane będą różnice w odpowiedziach pomiędzy cytrynianem magnezu a placebo (jednoczynnikowa ANCOVA) z wykorzystaniem pomiarów wyjściowych zmiennych wynikowych jako zmiennych kowariantnych. W celu sprawdzenia jako analizy wtórne, czy wpływ tlenku magnezu i siarczanu magnezu na sztywność tętnic jest nie gorszy niż wpływ cytrynianu magnezu na sztywność tętnic, wybrano margines nie gorszego wyniku (Δ) wynoszący 0,5 m/s w oparciu o wielkość efektu cytrynianu magnezu na sztywność tętnic stwierdzoną w poprzednich badaniach. W celu oceny różnic w odpowiedziach pomiędzy leczeniem magnezem i placebo przeprowadzona zostanie jednoczynnikowa ANCOVA, z wykorzystaniem pomiarów wyjściowych zmiennych wynikowych jako zmiennych. Aby udowodnić brak podrzędności, dolna granica przedziału ufności różnicy między siarczanem magnezu a cytrynianem magnezu oraz różnica między tlenkiem magnezu a cytrynianem magnezu nie może przekraczać granicy Δ, aby mieć 95% pewność, że tlenek magnezu i siarczan magnezu nie są gorsze od suplementów cytrynianu magnezu o więcej niż Δ. Efekty leczenia będą obliczane w każdym punkcie czasowym (po 2, 12 i 24 tygodniach) za pomocą jednoczynnikowej ANCOVA. Różnice są uważane za statystycznie istotne przy P < 0,01 dla analiz pierwotnych (potwierdzających) i P < 0,05 dla analiz wtórnych (eksploracyjnych). Analizy statystyczne będą wykonywane przy użyciu oprogramowania SPSS 23.0 dla Windows (SPSS Incorporated, Chicago, IL, USA). Normalność reszt będzie badana przy użyciu testu normalności Shapiro-Wilka. Jeśli reszta nie ma rozkładu normalnego, parametry zostaną poddane log-transformacji. Jeżeli po log-transformacji reszty nadal nie są normalnie rozłożone, stosuje się testy nieparametryczne. Brakujące dane nie będą zastępowane przez oszacowania. Ze względu na randomizację, oczekuje się, że czynniki zakłócające zostaną równo podzielone. Dlatego też nie będzie miała miejsca korekta z powodu czynników zakłócających. W analizach pierwotnych zastosowana zostanie zasada intention-to-treat. Po drugie, przeprowadzimy analizy per-protokół (wyłączymy z analizy statystycznej osoby, które nie zastosowały się do zaleceń). Aby udowodnić brak niższości, przedział ufności różnicy musi wykluczać margines zarówno w analizie intention-to-treat jak i per-protocol. Wreszcie, przeprowadzimy analizy podgrup, w których porównamy wpływ magnezu na sztywność tętnic u osób stosujących terapię przeciwnadciśnieniową i u osób nie stosujących terapii przeciwnadciśnieniowej. Ponieważ z czasem sztywność tętnic może wzrastać szybciej u osób leczonych z powodu nadciśnienia tętniczego, nasza hipoteza jest taka, że magnez może mieć wyraźniejszy wpływ na sztywność tętnic u osób leczonych przeciwnadciśnieniowo.