ChIP jest potężną techniką używaną do badania asocjacji specyficznych białek lub ich zmodyfikowanych izoform z określonymi regionami genomu. Jest to szybko rozwijająca się technika badawcza i jest powszechnie stosowana do mapowania interakcji DNA-białko w komórkach, które są kluczowe dla prawidłowej regulacji genów. Na przykład, mogą być używane do określenia, czy białka takie jak czynniki transkrypcyjne i zmodyfikowane histony wiążą się z określonym regionem DNA żywych komórek lub tkanek.
Genomowe mapowanie interakcji białko-DNA jest niezbędne do pełnego zrozumienia regulacji genów. Szczegółowa mapa znaczników epigenetycznych i wiązania czynników transkrypcyjnych jest niezbędna do wydedukowania sieci regulacyjnych, które leżą u podstaw ekspresji genów w różnych systemach biologicznych. Najpowszechniej stosowanym narzędziem do badania tych interakcji jest ChIP, a następnie masowo równoległe sekwencjonowanie (ChIP-seq)
Jak działa ChIP-seq?
ChIP-seq rozpoczyna się od tradycyjnego badania ChIP obejmującego utrwalanie komórek (sieciowanie), ścinanie chromatyny, immunoprecypitację (IP), odwrotne sieciowanie i oczyszczanie DNA. Żywe komórki są utrwalane za pomocą odwracalnego środka sieciującego w celu zachowania interakcji białko-DNA w ich naturalnych miejscach, a następnie są lizowane w celu uwolnienia chromatyny do ścinania. Po sieciowaniu, chromatyna jest ścinana do określonego zakresu wielkości (100-500 bp) w celu uzyskania optymalnych wyników IP i ChIP-seq. Zarówno sonikacja jak i enzymatyczne ścinanie mogą być użyte do osiągnięcia rozmiarów fragmentów pomiędzy 100-500 bp, chromatyna jest następnie immunoprecypitowana przy użyciu przeciwciała zainteresowania i izolowana.
ChIP wytworzy bibliotekę docelowych miejsc DNA, które były w bezpośrednim fizycznym kontakcie z mechanizmami regulacyjnymi in vivo. Adaptery oligonukleotydowe są następnie dodawane do fragmentów DNA, które były związane z interesującym nas białkiem, aby umożliwić masywnie równoległe sekwencjonowanie. Po selekcji wielkości, wszystkie powstałe w wyniku ChIP fragmenty DNA są sekwencjonowane jednocześnie, co pozwala na poszukiwanie asocjacji w całym genomie z wysoką rozdzielczością. Mapowanie sekwencjonowanych fragmentów do baz danych sekwencji całego genomu pozwala na szybką i efektywną analizę wzoru interakcji DNA dowolnego TF lub modyfikacji epigenetycznej.
ChIP-seq stało się możliwe dzięki postępowi technologicznemu, który pozwala na mapowanie całych genomów i dokładne wskazanie miejsc wiązania białek poprzez połączenie testów ChIP z platformami sekwencjonowania następnej generacji. Wskazanie konkretnej sekwencji genu, z którą wiąże się białko za pomocą ChIP-seq pomaga badaczom epigenetycznym posunąć naprzód ich badania interakcji białko-DNA i uzyskać cenny wgląd w rozwój chorób.
.