Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cinnamaldehyde

Selectie van enzymen voor de biosynthese van cinnamaldehyde

Cinnamaldehyde kan worden gesynthetiseerd uit l-fenylalanine en de biosynthese ervan vereist drie enzymatische reacties: (i) deaminatie van l-fenylalanine tot kaneelzuur door fenylalanine-ammoniak lyase (PAL, EC 4.3.1.24), (ii) zuur-thiolbinding van kaneelzuur aan cinnamoyl-CoA door 4-coumaraat:CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12), en (iii) reductie van cinnamoyl-CoA tot cinnamaldehyde door cinnamoyl-CoA reductase (CCR, EC 1.2.1.44) (Fig. 1a) . PAL is een alomtegenwoordig enzym dat in veel planten, schimmels en sommige bacteriën voorkomt, en het heeft verschillende activiteiten en specifieke eigenschappen, afhankelijk van de oorsprong van het enzym. Wij onderzochten twee PAL-enzymen, een van de plant Arabidopsis thaliana (AtPAL) en een ander van de bacterie Streptomyces maritimus (SmPAL), op hun geschiktheid om kaneelzuur in E. coli te produceren. In het geval van AtPAL zijn er vier isomeren, waaronder AtPAL1 tot en met AtPAL4, en eerder werd gerapporteerd dat de meeste daarvan (AtPAL1, 2 en 4) een vergelijkbaar hogere activiteit hebben dan AtPAL3 voor l-fenylalanine als substraat, zodat we AtPAL1 hebben geselecteerd als een vertegenwoordiger van plantaardige oorsprong. Hun kinetische constanten (Km) bedroegen respectievelijk 68 en 23 μM. Elk His-tagged PAL-enzym werd geproduceerd in E. coli BL21(DE3) en gezuiverd volgens de procedures beschreven in “Methoden”. Beide enzymen, AtPAL1 (78 kDa) en SmPAL (56 kDa), werden met succes gezuiverd (Additional file 1: figuur S1). Hoewel het expressieniveau van AtPAL1 niet zo hoog was dat de band niet kon worden gezien in de rijstroken 1 en 2 van SDS-PAGE, kon de band van AtPAL1 duidelijk worden gezien na affiniteitskolomchromatografie in rijstrook 3 waarin het geconcentreerde eluaat was geladen. De equivalente molariteit van elk gezuiverd PAL-enzym werd geïncubeerd met dezelfde hoeveelheid l-fenylalanine (als substraat), en de productie titer van kaneelzuur werd gekwantificeerd door high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) (Additional file 2: figuur S2). Zoals aangetoond in Fig. 1b, vertoonde SmPAL een significant hogere activiteit (21-voudig bij 30 °C reactie en 27-voudig bij 37 °C reactie) dan die van AtPAL1.

Wij onderzochten ook twee verschillende 4CL-enzymen, een van Streptomyces coelicolor (ScCCL) en een andere van A. thaliana (At4CL), op hun geschiktheid om kaneelzuur om te zetten in cinnamaldehyde in E. coli. In het geval van At4CL is bekend dat er 14 vermoedelijke isovormen zijn (At4CL1-At4CL14) . Onder de 14 isovormen hebben At4CL1-3 vergelijkbare activiteiten als cinnamaat, terwijl de rest van de isovormen dat niet doet. Daarom kozen we At4CL1 als representatief. Ook gebruikten we het CCR enzym van A. thaliana (AtCCR1) voor de omzetting van cinnamoyl-CoA in cinnamaldehyde. Elk 4CL-enzym (At4CL1 en ScCCL ) werd getest in combinatie met het CCR-enzym van A. thaliana (AtCCR). Alle enzymen werden met succes gezuiverd met een hoge zuiverheid (Additional file 1: Figuur S1). Om de enzymactiviteit van At4CL1 en ScCCL te vergelijken, werden twee reacties, (i) At4CL1 met AtCCR en (ii) ScCCL met AtCCR, geprepareerd en gemengd met kaneelzuur als substraat. Na incubatie bij 30 en 37 °C werd de titer aan cinnamaldehyde geanalyseerd met HPLC. Zoals aangetoond in Fig. 1c, resulteerde de combinatie van ScCCL en AtCCR in een hogere productie titer van cinnamaldehyde (4,4-voudig bij 30 °C reactie en 10,4-voudig bij 37 °C reactie) dan de combinatie van At4CL1 en AtCCR. Op basis van deze resultaten construeerden wij het cinnamaldehyde biosynthesesysteem in E. coli zoals hieronder beschreven, met gebruikmaking van de volgende enzymen: SmPAL, ScCCL, en AtCCR.

Constructie van cinnamaldehyde biosynthese route in E. coli

Om cinnamaldehyde te produceren in E. coli, werden SmPAL, ScCCL, en AtCCR genen gekloond in pTrc99A in de volgende volgorde: SmPAL, ScCCL, en AtCCR (resulterend in pHB-CAD) (Fig. 2a). E. coli W3110 die pHB-CAD bevatte werd gekweekt bij twee verschillende temperaturen (30 en 37 °C) om de optimale temperatuur voor de productie van cinnamaldehyde te vinden. De expressie van enzymen werd geanalyseerd door SDS-PAGE, gevolgd door Western blot analyse zoals beschreven in “Methoden”. Bij beide temperaturen kwamen alle enzymen goed tot expressie en waren ze goed oplosbaar (Fig. 2b). Hoewel elk enzym op een verschillend niveau tot expressie kwam, was de expressie van elk enzym marginaal beter bij 37 °C dan bij 30 °C. Analyse van de in het kweekmedium geproduceerde cinnamaldehyde-titer met HPLC toonde ook aan dat de cinnamaldehyde-productietiter 4,5-maal hoger was bij 37 °C dan bij 30 °C (Fig. 2c). We veronderstelden dat de hogere productietiter van cinnamaldehyde bij 37 °C werd veroorzaakt door het verhoogde expressieniveau van alle biosynthetische enzymen die bij 37 °C actief zijn, ook al zijn deze enzymen bij 30 °C ook actief. Hierna werden alle cultivaties voor de productie van cinnamaldehyde uitgevoerd bij 37 °C.

Strain engineering om de intracellulaire pool van l-fenylalanine te vergroten

Voor de biosynthese van cinnamaldehyde is l-fenylalanine nodig als essentiële precursor. Daarom, om de cinnamaldehyde productie te verbeteren, is het wenselijk om de intracellulaire pool van l-fenylalanine te verhogen. Voor dit doel hebben we E. coli rationeel herontworpen om meer l-fenylalanine te produceren. Met de beschikbare metabolische en regulatorische informatie als gids, ontwikkelden we E. coli W3110 als volgt: (i) schrapping van het crr-gen dat codeert voor het EIIAGlc-eiwit dat gerelateerd is aan het glucosespecifieke fosfoenolpyruvaat fosfotransferase systeem (PTS) voor het matigen van de substraatopnamesnelheid, het verminderen van metabolietoverloop en precursorverrijking, (ii) schrapping van het tyrR-gen om de strakke regulatie van het TyrR-regulon te verlichten dat genen voor aromatische aminozuursynthese (AAA) bevat, (iii) schrapping van de trpE (anthranilaat synthase component) en tyrA genen om het verlies van koolstofstroom naar concurrerende routes (biosynthese van l-tryptofaan en l-tyrosine) te voorkomen, en (iv) schrapping van het pykA (pyruvaat kinase A) gen om de precursor te verrijken en de flux tussen groei en l-fenylalanine productie in evenwicht te brengen (Fig. 3). Op basis van bovenstaand schema werden vijf opeenvolgende knock-outmutanten van E. coli W3110 ontwikkeld (YHP01-YHP05) (tabel 1).

Eerst werd een glucose-specifiek fosfoenolpyruvaat PTS geïnactiveerd door deletie van het crr-gen in E. coli W3110-stam, waardoor E. coli YHP01 ontstond. Hoewel dit het belangrijkste systeem voor glucose-internalisatie verstoort, kan YHP01 nog steeds groeien in gedefinieerde media met glucose als enige koolstofbron omdat het mannose-specifieke PTS en galactose-permease glucose kunnen blijven internaliseren in het cytoplasma. Het omzeilen van het PTS resulteert in een verhoogde pool van fosfoenolpyruvaat (PEP), dat uiteindelijk de synthese van l-fenylalanine vergemakkelijkt. Vervolgens verwijderden we het tyrR gen in YHP01 om YHP02 stam te bekomen. Het TyrR-eiwit is een regulator van het TyrR-regulon, dat acht genen bevat die betrokken zijn bij de biosynthese van AAA. De schrapping ervan kan ook de l-fenylalanine pool verhogen door de strakke regulatie van genen gerelateerd aan AAA synthese te verlichten. Vervolgens verwijderden we achtereenvolgens de genen trpE en tyrA, te beginnen met de YHP02 stam, wat respectievelijk de YHP03 en YHP04 stammen opleverde. In de biosyntheseroute van AAA’s treedt een laatste vertakking op waarbij chorismaat kan worden omgezet in l-fenylalanine, l-tryptofaan of l-tyrosine door respectievelijk PheA, TrpE of TyrA enzymen. De deleties van trpE en tyrA genen kunnen het verlies van koolstof in concurrerende routes voor l-tryptofaan en l-tyrosine biosynthese voorkomen. Tenslotte hebben we het pykA-gen in YHP04 geschrapt om de YHP05-stam te verkrijgen. Het pykA-gen codeert voor pyruvaat kinase A (PykA), dat de tweede PEP-consumerende stap vormt. Door schrapping van het pykA-gen kan meer PEP worden gebruikt in de shikimaatroute en kan bijgevolg meer l-fenylalanine worden geproduceerd. In elke stam (YHP01-YHP05) werd de deletie van de genen geverifieerd door PCR en agarosegelelektroforese (Additional file 3: figuur S3).

Alle gemanipuleerde E. coli-stammen, inclusief YHP01-YHP05 en de ouderlijke E. coli W3110, werden gekweekt in schudkolven met halfgedefinieerde media, en de celgroei en de l-fenylalanineproductie werden vergeleken. Na een kweek van 48 uur groeiden alle gemanipuleerde stammen iets beter dan de W3110 stam; in het bijzonder vertoonde de E. coli YHP05 stam de hoogste celdichtheid (Fig. 4a). In een vorige studie werd ook vastgesteld dat de inactivering van de PTS- en Pyk-isozymes de koolstofflux naar de vorming van biomassa deed toenemen door het effect van het behoud van verminderde hoeveelheden intermediaire metabolieten ten gevolge van een verminderde glucose-opname en katabolisme. We analyseerden ook de productietiter van l-fenylalanine in het kweeksupernatant met behulp van HPLC. In de ouderlijke W3110 stam bedroeg de productie titer van l-fenylalanine 0,24 g/L, maar de titer van l-fenylalanine werd geleidelijk verhoogd in de gemanipuleerde E. coli stammen (Fig. 4a). E. coli YHP05, waarin de genen crr, tyrR, trpE, tyrA en pykA waren verwijderd, vertoonde de hoogste titer voor de productie van l-fenylalanine (0,52 g/L), die 2,2-maal hoger was dan die van de ouderlijke E. coli W3110. Daarom besloten we om E. coli YHP05 stam te gebruiken voor verdere engineering.

Plasmide-gebaseerd overexpressiesysteem om de intracellulaire pool van l-fenylalanine te verhogen

Beginnend met E. coli YHP05 stam, werd de productie van l-fenylalanine verder verbeterd door plasmide-gebaseerde genoverexpressie. De terugkoppelingsremming in de l-fenylalaninesyntheseroute door shikimaat en l-fenylalanine werd verminderd door overexpressie van isozymes of het aanbrengen van mutaties in enzymen die betrokken zijn bij de shikimaatroute, als volgt: (i) overexpressie van het gen voor 3-deoxy-d-arabinoheptulosonaat-7-fosfaat (DAHP) synthase, dat gecodeerd wordt in aroG met engineering (AroG8/15), (ii) overexpressie van de genen ydiB en aroK, die coderen voor shikimaatdehydrogenase en shikimaatkinase om de koolstofstroom naar de shikimaatroute te vergroten, (iii) overexpressie van het pheA-gen dat codeert voor CHA-mutase/prefenaatdehydratase met engineering voor verbetering van de substraatbindingsaffiniteit (PheAfbr, dm), en iv) overexpressie van de galP (galactosepermease) en glk (glucokinase) genen om de glucose-opname te vergemakkelijken (Additional file 4: Figuur S4).

Voreerst, om feedback remming te verlichten, werd de plasmide pTac15kG geconstrueerd, die de gemanipuleerde aroG8/15 gen bevatte. AroG is het belangrijkste enzym dat betrokken is bij de synthese van DAHP, maar AroG wordt volledig geremd door l-fenylalanine (zo laag als 0,1 mM) . Het is bekend dat de introductie van twee mutaties (D146N en A202T) resulteerde in resistentie tegen feedback inhibitie zonder de hoge specifieke activiteit (AroG8/15) te beïnvloeden, dus hebben we dit mutant AroG8/15 enzym overgeëxpresseerd. Vervolgens werden twee plasmiden (pTac15kGB en pTac15kGBK) geconstrueerd voor de overexpressie van respectievelijk ydiB en aroK genen samen met aroG8/15 gen. De metabolische flux naar de shikimaatroute kan worden verhoogd wanneer shikimaatdehydrogenase (YdiB) en shikimaatkinase (AroK) worden overgeëxpresseerd. Vervolgens werd pTac15kGBKA plasmide geconstrueerd voor de overexpressie van pheA gen dat codeert voor chorismaat mutase/prefenaat dehydratase met mutaties. In dit construct hebben we alleen de eerste 300 aminozuren van wild-type PheA (PheAfbr) geamplificeerd, waarbij het regulatoire domein is uitgesloten; daarom wordt PheAfbr zwak beïnvloed door feedback remming. Bovendien, omdat PheAfbr een hogere Km waarde heeft dan wild-type PheA, wat zijn verminderde bindingsaffiniteit met het substraat weerspiegelt, hebben we twee mutaties (E159A en E232A) in PheAfbr aangebracht om zijn substraat-bindende affiniteit te verhogen, wat resulteert in PheAfbr, dm . Tenslotte werd pYHP plasmide geconstrueerd om galP en glk genen extra te overexpresseren, die respectievelijk galactose permease en glucokinase coderen. Beide enzymen vergemakkelijken de glucose-opname.

Na de constructie van vijf plasmiden, waaronder pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBKA, en pYHP (tabel 1), werd elk plasmide getransformeerd in E. coli YHP05. Na een kweek van 48 uur in schudkolven met halfgedefinieerde media werden de celgroei en de productietiter van l-fenylalanine geanalyseerd. Alle cellen groeiden goed, en vooral E. coli YHP05 met pYHP groeide tot een marginaal hogere celdichtheid (OD600 = 9,76) dan de andere (Fig. 4b). We analyseerden ook de productietiter van l-fenylalanine in het kweeksupernatant met HPLC. Overexpressie van het aroG8/15-gen (pTac15kG) resulteerde in een significante toename van de l-fenylalanineproductie (2,25 g/L) in vergelijking met YHP05 zonder plasmide (0,52 g/L) (Fig. 4b). De daaropvolgende overexpressie van andere genen resulteerde in een seriële toename van de productietiter van l-fenylalanine en E. coli YHP05 met pYHP vertoonde de hoogste l-fenylalanineproductietiter (3,91 g/L) (Fig. 4b). Het effect van pYHP plasmide resulteerde in een significante toename van de l-fenylalanine productie tot respectievelijk het 16,4-voudige en het 7,5-voudige. In de kweek van E. coli YHP05 harboring pYHP, l-fenylalanine opbrengst op glucose en de productiviteit waren 0,270 g / g en 0,082 g / L / h, respectievelijk (Additional file 5: figuur S5). Dus, in de gemanipuleerde E. coli YHP05 met pYHP, werd de pool van l-fenylalanine aanzienlijk verbeterd. Liu et al. rapporteerden eerder de productie van l-fenylalanine in E. coli tot 47 g/L. Dit record kon echter worden bereikt in de fed-batch kweek (schaal 15 L) en zij gebruikten de co-expressie van l-fenylalanine transporter (YddG) voor de efficiënte productie van l-fenylalanine in het kweekmedium. In ons werk hebben wij het YddG niet geïntroduceerd omdat het uiteindelijke doel van ons werk niet de productie van l-fenylalanine was, maar de productie van cinnamaldehyde. Hoewel de in ons werk bereikte titer van l-fenylalanine geen hoogterecord was, dachten wij dat het hoog genoeg was voor de productie van cinnamaldehyde. Daarom besloten we deze gemanipuleerde stam te gebruiken voor de productie van cinnamaldehyde.

Cinnamaldehyde productie in de gemanipuleerde E. coli

Met de gemanipuleerde E. coli YHP05 die pYHP bevat, onderzochten we eerst de productie van cinnamaldehyde. Voor dit experiment werd het plasmide pHB-CA, dat SmPAL-gen onder IPTG-induceerbare trc-promotor bevat, geconstrueerd (tabel 1). E. coli YHP05 met zowel pHB-CA als pYHP werd gekweekt in kolven gedurende 48 uur en de productietiter van kaneelzuur werd geanalyseerd. E. coli YHP05 en E. coli W3110 met pHB-CA (zonder pYHP) werden ook onderzocht als controles. De groeipatronen van alle cellen waren vergelijkbaar (Fig. 5a) en E. coli W3110 en YHP05 die pHB-CA bevatten produceerden 79 en 108 mg/l kaneelzuur, respectievelijk (Fig. 5b). E. coli YHP05 die zowel pHB-CA als pYHP bevatte, vertoonde een significant verbeterde productietiter (287 mg/L), die 3,6-maal en 2,7-maal hoger was dan die van E. coli W3110 en YHP05 die pHB-CA bevatten, respectievelijk (Fig. 5b). Voor zover wij weten was deze productietiter ook 1,5 maal hoger dan het hoogste niveau (186 mg/L) dat bij E. coli werd gerapporteerd. Dit resultaat geeft duidelijk aan dat de verhoging van de hoeveelheid l-fenylalanine in de gemanipuleerde E. coli-stam positief bijdraagt tot een verhoging van de kaneelzuurproductie.

Als hoofddoel onderzochten we de cinnamaldehydeproductie in de gemanipuleerde E. coli YHP05-stam, die werd getransformeerd met pHB-CAD en pYHP. Ook E. coli YHP05 en E. coli W3110 met pHB-CAD (zonder pYHP) werden onderzocht als controles. De celgroei was vergelijkbaar (Fig. 6a), en drie cinnamaldehyde biosynthese enzymen kwamen goed tot expressie in alle onderzochte cellen (Additional file 6: Figuur S6). Na kweek gedurende 48 uur werden de supernatanten van de kweek verzameld en werden de productietiters van cinnamaldehyde bepaald met HPLC. E. coli W3110 (pHB-CAD) en E. coli YHP05 (pHB-CAD) vertoonden cinnamaldehydeproductietiters van respectievelijk 2,18 en 6,3 mg/L (Fig. 6b). Daarentegen vertoonde E. coli YHP05 (pHB-CAD en pYHP) een significant hogere productietiter (75 mg/L), die 35-maal hoger was dan die van E. coli W3110 (pHB-CAD).

Nematicidale activiteit van kaneelaldehyde geproduceerd door gemanipuleerde E. coli

Om de nematicidale activiteit van kaneelaldehyde geproduceerd in kweekmedium te evalueren, werden nematoden, B. xylophilus, behandeld met kaneelaldehyde volgens de procedures beschreven in “Methoden” . Het kweeksupernatant van E. coli YHP05 met pYHP en pHB-CAD werd verdund tot de eindconcentratie van cinnamaldehyde 60 mg/L bedroeg, en de nematoden werden behandeld met het verdunde kweeksupernatant. Na 1 en 4 uur overleefde respectievelijk slechts 26 % en minder dan 18 % van de nematoden (Fig. 7). Als positieve controle werden de nematoden behandeld met in de handel verkrijgbaar en gezuiverd cinnamaldehyde in een equivalente concentratie (60 mg/l). Na 4 uur waren bijna alle nematoden (95 %) gedood. Deze resultaten gaven aan dat de nematicidale activiteiten vergelijkbaar waren tussen in de handel verkrijgbaar kaneelaldehyde en het in deze studie geproduceerde cinnamaldehyde. Als negatieve controle werd ook het kweeksupernatans van E. coli W3110 getest en zoals verwacht overleefden bijna alle nematoden (>92 %) na 4 uur.