De bepaling van organische sporenverbindingen in de analyse van levensmiddelen is van groot belang voor de aspecten voedselkwaliteit en voedselveiligheid. Zowel de scheiding van de analyt van mogelijke afleidingen in de voedselmatrix, als de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van de doelverbinding, zijn vitale stappen in de analytische voedingsmiddelenchemie.
Definitie
Liquid Chromatography (LC, hier High Performance LC – HPLC) is een fysische scheidingstechniek voor sporenanalyse. Zij is gebaseerd op de interactie van een analyt met een stationaire fase (kolom met deeltjes) en een mobiele fase (vloeibaar eluent of een mengsel van eluenten). Massaspectrometrie (MS) is het analyse-instrument om de samenstelling van een monster te meten. De MS genereert nuttige informatie over het molecuulgewicht en de structuur van analyten en helpt bij de opheldering van onbekende verbindingen.
De combinatie, LC/MS, LC-MS is een krachtige techniek, vanwege de zeer hoge gevoeligheid (tot in het ppt-bereik) en specificiteit. Op het gebied van de analyse van organische sporen wordt MS voor talrijke toepassingen gebruikt, maar in tegenstelling tot GC/MS (gaschromatografie, gekoppeld aan massaspectrometrie) is het speciaal bestemd voor de analyse van monsters die niet-vluchtige analytische targets bevatten, meestal met een massa tussen 200 – 800u, die thermisch labiel zijn, een hoge polariteit vertonen of een hoge molecuulmassa hebben.
Webinar: Strategie ter voorkoming van voedselfraude – een wereldwijd perspectief op testen, monitoring en verificatie
In dit webinar wordt ingegaan op de rol die het testen van de echtheid van voedingsmiddelen kan spelen in een strategie ter voorkoming van voedselfraude. Ook wordt gewezen op de noodzaak van een holistische visie die de identificatie van risico’s, de uitvoering van een plan voor de preventie van voedselfraude, het beheer van de toeleveringsketen, de voedselveiligheidscultuur van het bedrijf en laboratoriumtests omvat.
REGISTREER NU
Werkingsprincipe
In principe moet een LC/MS-apparaat de vier werkstappen uitvoeren, waaronder:
- Chromatografische scheiding van de analyten door een scheidingskolom
- Ionisatie van de analyt
- Isolatie van de ionen en
- Identificatie van de ionen
In het algemeen is het niet triviaal om een HPLC-systeem te koppelen aan een massaspectrometer, aangezien de moeilijkheid erin bestaat een opgeloste stof om te zetten in een ion in de gasfase. De uitdaging bestaat erin zich te ontdoen van het oplosmiddel en tegelijkertijd een adequaat vacuümniveau in de massaspectrometer te handhaven en de gasfase-ionen te genereren. Daarom worden componenten die uit de chromatografische kolom elueren via een gespecialiseerde interface in de massaspectrometer gebracht.
De twee meest gebruikte ionisatie-interfacesystemen, atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) en electrospray-ionisatie (ESI), worden gekozen afhankelijk van de fysisch-chemische eigenschappen van de analyten (d.w.z. polariteit en zuurgraad). De ionisatie vindt plaats bij atmosferische druk en beide worden beschouwd als een zachte ionisatiemethode, d.w.z. dat het massaspectrum hoofdzakelijk informatie over het molecuulgewicht oplevert, tenzij fragmentatietechnieken worden gebruikt.
Aangezien verbindingen gedeeltelijk co-elueren uit het chromatografisch systeem, kan een duidelijke toewijzing van de afzonderlijke fragmenten niet worden bereikt met alleen LC-MS, waar alleen molecuulionmassa’s beschikbaar zijn. Om dit probleem op te lossen wordt tegenwoordig hoofdzakelijk gebruik gemaakt van tandemmassaspectrometrie (MS/MS), waarbij de massa’s in verschillende stappen worden geselecteerd of geanalyseerd (LC/MS/MS of LC/MSn). Deze systemen zijn in staat residuen in het lagere ppt-bereik te bepalen. Voor de kwalificatie van organische moleculen is een andere technische MS-opstelling nodig. Een mogelijke benadering voor de kwalificatie is het gebruik van een MS die ionen genereert, deze naar een lineaire ionenval leidt en ze vervolgens opslaat in een radiofrequentieveld. Daarna maken verschillende technische mogelijkheden de kwalificatie van de ionen en derhalve van de onbekende verbinding mogelijk.
Toepassingen
Sinds de introductie in routine-analyses ongeveer tien jaar geleden, is LC/MS ingeburgerd in de meeste gebieden van de analytische chemie, b.v. kwaliteitscontrole, fundamenteel en toegepast onderzoek en overheidscontrole.
De volgende voorbeelden geven een kort overzicht:
a) Farmacie
- Pharmacokinetische studies van geneesmiddelen, b.v. afbraakprocessen van geneesmiddelen
- Ontwikkeling van geneesmiddelen, b.v. metabolietidentificatie of onzuiverheidsidentificatie
b) Moleculaire biologie
- Proteomics, b.v. grootschalige studie van proteïnen, in het bijzonder hun structuren en functies
- Metabolomics, b.v.b.v. bepaling van metabolische tussenproducten, hormonen en andere signaalmoleculen
c) Milieu
- Afvalwater, b.v. endocriene verbindingen
- Bodem, b.v. organometalen
d) Voeding
- Ingrediënten, b.v. aminozuren, lipiden
- Verontreinigingen, b.v. multiresidu-analyse van pesticiden, zeevruchtentoxinen, residuen van diergeneesmiddelen, bepaling van kleurstoffen, acrylamide, analyse van microcystinen
- Natuurlijke producten, b.v. terpenen, steroïden
Perfluorinated tensides (PFC) als voorbeeld bij de analyse van levensmiddelen
Achtergrond
PFC is een uitstekend voorbeeld om complexe monstervoorbereiding te combineren met gesofisticeerde LC/MS-apparatuur en een grondige kennis in analytische chemie. De unieke eigenschappen van PFT maken ze bruikbaar in een reeks industriële en commerciële produkten, zoals koelvloeistoffen, polymeren en als bestanddeel in farmaceutische produkten en bestrijdingsmiddelen. Met name geperfluoreerde carboxylaten (b.v. PFOA – perfluoroctaanzuur) en geperfluoreerde sulfonaten (b.v. PFOS – perfluoroctansulfonzuur) worden gebruikt als oppervlakteactieve stoffen, b.v. om textiel en tapijten te impregneren, in blusschuim en voor vetafstotende behandelingen in de papierindustrie. PFC wordt al meer dan 50 jaar geproduceerd en wordt nu wereldwijd gedistribueerd. Als de C-H bindingen niet volledig worden vervangen door C-F bindingen, een van de sterkste chemische bindingen die bekend zijn, blijft afbraak mogelijk.
Alleen PFOA en PFOS zijn toxicologisch beoordeeld (chronisch toxisch en carcinogeen), alle andere homologe verbindingen, isomeren enz. zijn nog niet beoordeeld. Vanuit fysisch oogpunt zijn PFK’s zowel persistent (d.w.z. niet afbreekbaar) als mobiel (d.w.z. zij kunnen uit verontreinigde bodems in het grondwater terechtkomen). Dit vormt een permanente bedreiging in de context van de winning en/of conditionering van drinkwater. Bovendien komen deze verbindingen via plantenoverdracht in de voedselketen terecht.
De ontdekking van hoge PFK-verontreinigingsniveaus in twee Duitse rivieren in 2006 wekte de publieke belangstelling voor deze verbindingen.
De verontreiniging van 2006 is wellicht afkomstig van organisch slib dat als meststof voor landbouwdoeleinden is gebruikt. Gebleken is dat de bodem tot 600 µg PFK/kg bevat, waardoor het drinkwater en de toeleveringsinstallaties verontreinigd zijn. Tot dusver hebben zeven Duitse deelstaten melding gemaakt van PFC-verontreiniging.
Fraunhofer IME
Een van de kerncompetenties van het Fraunhofer-instituut voor moleculaire biologie en toegepaste ecologie is de ontwikkeling van haalbare en betrouwbare methoden voor de identificatie en analyse van chemische verontreinigingen in voedingsmiddelen en milieumatrices.
Sinds 1999 heeft het Fraunhofer IME projecten uitgevoerd om PFC-verontreiniging in diverse milieumatrices te meten. Dit werk is uitgevoerd in opdracht van industriële partners en was met name gericht op PFK-carboxylaten en PFK-sulfonaten. Verder zijn er onderzoeken uitgevoerd ten behoeve van het monitoringprogramma van de Duitse federale milieuspecimenbank, waarbij ook menselijke bloedmonsters zijn onderzocht. In 2005 werden de eerste onderzoeken op het gebied van levensmiddelen uitgevoerd en in 2006 werden de resultaten van geselecteerde levensmiddelenmonsters (bijv. moedermelk, frites) ook in de media besproken. In 2007 werden grotere projecten uitgevoerd die gericht waren op plantentransfer, aardappelen en producten, menselijke matrices (bloed en moedermelk), alsook milieumonsters (bv. afvalwater, slib en bodem).
Analytische oplossing
Drie verschillende monstervoorbereidingen werden toegepast om alle mogelijke monstermatrices te bestrijken:
- IPE (Ion pair extraction). Gebruik van ionenpaardextract tetra-n-butylammoniumhydrogensulfaat gevolgd door een vloeistof vaste stof extractie (b.v. milieumonsters)
- AAE (zuur alkalische extractie). Verwijdering van de lipiden met hexaan bij pH 14 (vloeibare ammoniakoplossing), aanpassing aan pH 1 met zoutzuur en extractie met tert-butylether (bv. moedermelk)
- SPE (vaste fase-extractie, momenteel meest geciteerde methode) met patronen van verschillende polariteit, afhankelijk van het ionische karakter van de PFC in een gebufferd medium (bv.b.v. aardappel)
Het gebruik van interne standaarden voor kalibratie wordt sterk aanbevolen; momenteel omvatten onze methoden negen met massa gelabelde PFC-standaarden. Voordat de monsters in de LC/MS worden gebracht, moet het apparaat zelf worden gecontroleerd op onderdelen met tefloncoating, omdat deze PFK’s bevatten die de resultaten op een niet reproduceerbare wijze beïnvloeden. Deze onderdelen moeten worden vervangen, hetgeen een superieure kennis van de LC/MS componenten vereist.
Analytisch voorbeeld
Voor de analyses van rauwe aardappel en aardappelprodukten hebben wij onze LC/MS/MS (HPLC Alliance 2695 met Quattro Ultima Pt in Electrospray negatieve modus, beide Waters aangepast; 150 x 2 mm Luna 3 µm C18(2)-kolom, Phenomenex) systeem voor doelmassa’s van 9 perfluorcarbonzuren (C4 – C12) en 3 perfluorsulfonzuren (C4, C6, C8) met gebruikmaking van 13C-gelabelde referentiematerialen (LOQ 0.5 µg/Kg) na een SPE-monstervoorbereiding.
PFK’s vertoonden een verschillende verdeling in rauwe aardappel en in aardappelproducten (tabel 1), wat de veronderstelling van een verontreiniging tijdens de verwerking, alsook van bodemverontreiniging mogelijk maakt. Dit kan worden ondersteund door ons PFC-frietonderzoek uit 2006, waarbij we frites van fastfoodrestaurants analyseerden en tot 2,8 µg PFOA/kg en tot 0,9 µg PFOS/kg vonden.
Analytische vooruitzichten
Het Fraunhofer IME beschikt over aanzienlijke expertise en ervaring op het gebied van PFC-analyse, die zou kunnen worden toegepast op veel nog niet onderzochte gebieden van PFC-verontreiniging in het milieu/voedsel. Belangrijke gebieden voor toekomstig PFC-onderzoek zijn onder andere uitbreiding van het aantal analyten, veel korte- en lange-keten PFC zijn al opgenomen in ons studieprogramma, maar onze analytische capaciteit zou kunnen worden verbeterd door het opnemen van extra PFC. De extra PFK’s moeten met LC/MS worden geïdentificeerd omdat er geen commerciële standaarden beschikbaar zijn. Dit zal leiden tot geconsolideerde bevindingen over de precursoren, de routes van voedselcontaminatie en de afbraak tijdens de verwerking van levensmiddelen.
