GFP
Green Fluorescent Protein (GFP) is een enkel polypeptide genproduct van 238 aminozuren dat werd ontdekt in de kwal Aequorea victoria. Het eiwit heeft een natuurlijke groene fluorescentie onder specifieke belichtingsomstandigheden. Het eiwit ontleent zijn bioluminescentie aan Ser-Tyr-Gly cyclisatie binnen zijn primaire aminozuursequentie. GFP is vrij stabiel en is bestand tegen een aantal chemische behandelingen en procedures.1 De eerste demonstratie dat dit fluorescerend eiwit tot expressie kon worden gebracht in een heteroloog systeem was in C. elegans.2 GFP is sindsdien een reportergen bij uitstek geworden omdat het geen biochemische transformatie, contrastmiddel of het gebruik van schadelijke ioniserende straling vereist om gevisualiseerd te kunnen worden.3 Sinds dat eerste rapport is expressie van het GFP reportergen gerapporteerd in meerdere organismen, waaronder muizen.4 Bovendien kunnen transgene GFP muizen, onder leiding van een specifieke promotor, het fluorescerende eiwit tot expressie brengen in een weefselspecifieke en zelfs een celspecifieke manier. De niet-invasieve visualisatie is de sleutel tot het kunnen volgen van fysiologische en biochemische processen in vivo en in real time.5
Er zijn talrijke manieren om de bioluminescentie van GFP te visualiseren. Eén manier om de fluorescentie te detecteren is met een hand-held UV-lamp (365 nM). Fisher biedt verschillende modellen aan in een prijsklasse van ongeveer $ 100 tot $ 200. De met de hand bediende UV-lichtmethode werkt niet erg goed voor de GFPX transgene stam (Stock 003116). Dr. Andras Nagy, donerend onderzoeker van GFPX en GFPU transgenics (Stock 003115 en 003116), beschrijft een kijker headset en een microscoop aanpasbaar filter die nu commercieel beschikbaar zijn.
CFP en YFP
Recente vorderingen hebben de kenmerken en het nut van GFP als een reporter gen verbeterd. Enhanced GFP (EGFP) is ontwikkeld om op hogere niveaus in zoogdiercellen tot expressie te komen en intenser te fluoresceren. Cyan Fluorescent Protein (CFP) en Yellow Fluorescent Protein (YFP) zijn spectrale varianten van GFP waarmee meerdere celtypes tegelijk kunnen worden gelabeld.
Cubitt AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gross LA, Tsien RY. 1995. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem Sci 20:448-55.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. 1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263:802-5.
Hoffman RM. 2002. Green fluorescent protein imaging of tumor cells in mice. Lab Animal 31(4): 34-41.
Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. 1997. Green mice’ as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett 407:313-9.
Yang M, Baranov E, Jiang P, Sun FX, Li XM, Li L, Hasegawa S, Bouvet M, Al-Tuwaijri M, Chishima T, Shimada H, Moossa AR, Penman S, Hoffman RM. 2000. Whole-body optical imaging of green fluorescent protein-expressing tumors and metastases. Proc Natl Acad Sci USA 97:1206-11.
lacZ
Het gebruik van een reportergen kan het mogelijk maken ruimtelijke patronen van genexpressie van een bepaalde promotor binnen een weefsel, embryo of volwassen muis te onderzoeken.1 Het E. coli lacZ gen kan, wanneer het door transgene technieken in het muizengenoom is geïntegreerd, worden gebruikt als een reportergen onder de controle van een bepaalde promotor/enhancer in een transgene expressiecassette. Het lacZ-gen codeert voor betagalactosidase, dat de splitsing van lactose katalyseert om galactose en glucose te vormen. Beta-galactosidase activiteit kan worden geïdentificeerd door zowel in situ als in vitro technieken wanneer geïncubeerd met het beta-galactosidase substraat X-gal. Beta-galactosidase splitst X-gal, een chromogeen substraat, wat resulteert in een onoplosbare blauwe kleurstof, waardoor cellen met lacZ activiteit kunnen worden geïdentificeerd.2 Transgene dieren kunnen dan worden gebruikt om factoren en omstandigheden te identificeren die het expressieprofiel van de promoter of enhancer moduleren.