Een van de belangrijkste procedures in de virologie is het meten van de virustiter – de concentratie virussen in een monster. Een veel gebruikte methode om de hoeveelheid besmettelijk virus te bepalen is de plaque-assay. Deze techniek werd voor het eerst ontwikkeld om de titer van bacteriofaagvoorraden te berekenen. Renato Dulbecco heeft deze procedure in 1952 gewijzigd voor gebruik in de dierlijke virologie, en sindsdien is zij gebruikt voor betrouwbare bepaling van de titers van veel verschillende virussen.
Om een plaquettebepaling uit te voeren worden 10-voudige verdunningen van een virusvoorraad bereid, en 0,1 ml aliquots worden geïnoculeerd op vatbare celmonolayers. Na een incubatieperiode, waarin het virus zich aan de cellen kan hechten, worden de monolayers bedekt met een voedingsbodem die een stof bevat, meestal agar, die de vorming van een gel veroorzaakt. Wanneer de platen worden geïncubeerd, laten de oorspronkelijke geïnfecteerde cellen virale nakomelingen los. De verspreiding van de nieuwe virussen wordt door de gel beperkt tot naburige cellen. Bijgevolg produceert elk infectieus deeltje een cirkelvormige zone van geïnfecteerde cellen die een plaque wordt genoemd. Uiteindelijk wordt de plaque groot genoeg om met het blote oog zichtbaar te zijn. Kleurstoffen die levende cellen kleuren worden vaak gebruikt om het contrast tussen de levende cellen en de plaques te vergroten. Alleen virussen die zichtbare schade aan cellen toebrengen, kunnen op deze manier worden onderzocht. Een voorbeeld van door poliovirus gevormde plaques op een monolaag van HeLa-cellen is links te zien. Op deze afbeelding zijn de cellen gekleurd met kristalviolet en zijn de plaques goed zichtbaar op de plaatsen waar de cellen door de virusinfectie zijn vernietigd.
De titer van een virusvoorraad kan worden berekend in plaque-vormende eenheden (PFU) per milliliter. Om de virustiter te bepalen, worden de plaques geteld. Om fouten tot een minimum te beperken, worden alleen platen geteld die tussen 10 en 100 platen bevatten, afhankelijk van de grootte van de celkweekplaat die wordt gebruikt. Statistische principes schrijven voor dat wanneer 100 platen worden geteld, de titer van het monster zal variëren met plus of min 10%. Elke verdunning wordt in duplo uitgezet om de nauwkeurigheid te vergroten. In het hieronder getoonde voorbeeld zijn er 17 platen op de plaat van de 10-6 verdunning. De titer van de virusvoorraad is daarom 1,7 x 108 PFU/ml.
Volgende zullen we bekijken hoe de plaque-assay kan worden gebruikt om klonale virusvoorraden te bereiden, een stap die essentieel is voor het bestuderen van virale genetica.
Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 273-279