Linkage Distance and Gene Order From Three-Point Crosses
Door een derde gen toe te voegen, hebben we nu verschillende types van kruisingsoverproducten die kunnen worden verkregen. De volgende figuur toont de verschillende combinatieproducten die mogelijk zijn.
Als we nu een testkruising met F1 zouden uitvoeren, zouden we een verhouding van 1:1:1:1:1:1:1:1 verwachten. Net als bij de hierboven beschreven tweepuntsanalyses geeft een afwijking van deze verwachte verhouding aan dat er koppeling optreedt. De beste manier om vertrouwd te raken met de analyse van driepunts-testcrossgegevens is een voorbeeld te doorlopen. We zullen het willekeurige voorbeeld gebruiken van de genen A, B, en C. We maken eerst een kruising tussen individuen die AABBCC en aabbcc zijn. Vervolgens wordt deF1 proefgekruist met een individu dat aabbcc is. We zullen de volgende gegevens gebruiken om de genvolgorde en de overervingsafstanden te bepalen. Net als bij de tweepuntsgegevens zullen we de F1-gametensamenstelling bekijken.
| Genotype | Waargenomen | Type gameet |
|---|---|---|
| ABC | Ouder | |
| abc | Ouder | |
| AbC | Enkelvoudige-kruising tussen de genen C en B | |
| aBc | Single- crossover tussen de genen C en B | |
| ABc | Dubbel-crossover | |
| abC | Double-crossover | |
| abc | Single-crossover tussen genen A en C | |
| aBC | Single-crossover tussen genen A en C | |
| Totaal |
De beste manier om deze problemen op te lossen is het ontwikkelen van een systematische aanpak.Eerst moet worden bepaald welke van de genotypen de ouderlijke genotypen zijn.De genotypen die het vaakst worden aangetroffen, zijn de ouderlijke genotypen.Uit de tabel blijkt duidelijk dat de genotypen ABC en abc de ouderlijke genotypen zijn.
Nogmaals moeten we de volgorde van de genen bepalen. Zodra we de ouderlijke genotypen hebben bepaald, gebruiken we die informatie samen met de informatie die we hebben verkregen uit de dubbele kruising. De dubbelgekruiste gameten komen altijd het laagst voor. Uit de tabel blijkt dat de ABc- en abC-genotypes de laagste frequentie hebben. Het volgende belangrijke punt is dat bij een dubbele kruising het middelste allel van het ene naar het andere zusterschromatide wordt overgebracht. Hierdoor komt het niet-ouderlijke allel van het middelste gen op een chromosoom te liggen met de ouderlijke allelen van de twee flankerende genen. We kunnen uit de tabel zien dat het C-gen in het midden moet liggen omdat het recessieve c-allel nu op hetzelfde chromosoom ligt als de A- en B-allelen, en het dominante C-allel op hetzelfde chromosoom als de recessieve a- en ballelen.
Nu we weten dat de genvolgorde ACB is, kunnen we de overbruggingsafstanden tussen A en C, en C en B gaan bepalen. De afstammingsafstand wordt berekend door het totale aantal recombinante gameten te delen door het totale aantal gameten. Dit is dezelfde aanpak als bij de tweepuntsanalyses die we eerder hebben uitgevoerd. Wat anders is, is dat we nu ook rekening moeten houden met de dubbele-kruisingen. Voor deze berekeningen nemen we die dubbele kruisingen mee in de berekeningen van beide intervalafstanden.
Dus de afstand tussen de genen A en C is 17.9 cM, en de afstand tussen C en Bis 7.0 cM .
Nu gaan we een probleem van Drosophila proberen, door de principes toe te passen die we in het bovenstaande voorbeeld hebben gebruikt. De volgende tabel geeft de resultaten weer die we zullen analyseren.
| Genotype | Waargenomen | Type gameet |
|---|---|---|
| v cv+ ct+ | Ouder | |
| v+ cv ct | Ouder | |
| v cv ct+ | Single-kruising tussen genen ct en cv | |
| v+ cv+ ct | Enkelvoudig-crossover tussen genen ct en cv | |
| v cv ct | Single- crossover tussen genen v en ct | |
| v+ cv+ ct+ | Single-kruising tussen genen v en ct | |
| v cv+ ct | Dubbele-crossover | |
| v+ cv ct+ | Double-crossover | |
| Totaal |
Stap 1: Bepaal de ouderlijke genotypes.
De meest voorkomende genotypen zijn de partenale genotypen. Deze genotypen zijn v cv+ ct+ en v+ cv ct.Wat verschilt van onze eerste driepuntskruising, is dat de ene ouder niet alle dominante allelen en de andere niet alle recessieve allelen bevat.
Stap 2: Bepaal de genvolgorde
Om de genvolgorde te bepalen, hebben we zowel de oudergenotypen als de dubbele-kruisingsgenotypen nodig.Zoals we hierboven al zeiden, zijn de minst frequente genotypen de dubbele-kruisingsgenotypen. Deze genotypes zijnv cv+ ct en v+ cv ct+.Uit deze informatie kunnen we de volgorde bepalen door de vraag te stellen: In de dubbele-kruisingsgenotypes, welk ouderallel is niet geassocieerd met de twee ouderallelen waarmee het geassocieerd was in de oorspronkelijke ouderkruising. Bij de eerste dubbele kruising, v cv+ ct, is het ct-allel geassocieerd met de v- en cv+-allelen, twee allelen waarmee het bij de oorspronkelijke kruising niet geassocieerd was. Daarom is ct in het midden, en de genvolgorde is v ct cv.
Stap 3: Bepaling van de koppelingsafstanden.
-
v – ct afstandsberekening. Deze afstand wordt als volgt afgeleid: 100*((89+94+3+5)/1448) = 13.2 cM
-
ct – cv afstandsberekening. Deze afstand wordt als volgt berekend: 100*((45+40+3+5)/1448) = 6.4 cM
Stap 4. Teken de kaart.
Driepuntskruisingen maken het ook mogelijk om interferentie (I) tussen crossover-gebeurtenissen binnen een gegeven regio van een chromosoom te meten. Met name de hoeveelheid dubbele crossover geeft een indicatie of er interferentie optreedt. Het concept is dat gegeven specifieke recombinatiesnelheden in twee aangrenzende chromosomale intervallen, de mate van dubbele crossovers in deze regio gelijk moet zijn aan het product van de enkele crossovers. In het hierboven beschreven v ct cv voorbeeld was de recombinatiefrequentie 0.132 tussen de genen v en ct, en de recombinatiefrequentie tussen ct en cv was 0.064. Daarom zouden we 0.84% dubbele recombinanten verwachten. Met een steekproefgrootte van 1448, zou dit neerkomen op 12 dubbele recombinanten. In werkelijkheid werden er slechts 8 gedetecteerd.
Om interferentie te meten, berekenen we eerst de coëfficiënt van incidentie (c.o.c.) die de verhouding is tussen de waargenomen en de verwachte dubbele recombinanten. Interferentie wordt dan berekend als 1 – c.o.c. De formule is als volgt:
Voor de v ct cv-gegevens is de interferentiewaarde 33%.
De interferentiewaarden liggen meestal tussen 0 en 1. Waarden kleiner dan 1 geven aan dat er in deze regio van het chromosoom interferentie optreedt.