Resultaten en discussie
Twee modi van DNA-splitsing door R.KpnI in aanwezigheid van Mg2+.
R.KpnI is een REase met een hoge mate van preferentie in Mg2+ gekatalyseerde reacties in tegenstelling tot de meeste andere REases (11, 12). In Fig. 1 A wordt het karakteristieke splijtingspatroon door R.KpnI getoond in een bereik van Mg2+ concentraties. Bij lagere concentraties van het metaalion (50-500 μM) werd alleen splitsing van de cognate sequentie waargenomen (lanen 2-5). Bij concentraties van Mg2+ >500 μM was er echter duidelijk sprake van promiscue splitsing (rijstroken 6-9). De specifieke en promiscue modi van splitsing door R.KpnI afhankelijk van de Mg2+ concentratie werden gestaafd door analyse van de splitsing van oligonucleotiden. Het oligonucleotidesubstraat dat de canonieke sequentie bevatte, werd door R.KpnI zelfs bij 20 μM Mg2+ efficiënt gekliefd. Nietcanonieke sequenties werden daarentegen pas bij >500 μM Mg2+ efficiënt gekliefd. Deze resultaten impliceren dat R.KpnI twee verschillende metaalactiveringsprofielen vertoont – een voor canonieke en een voor niet-canonieke DNA-substraten. Het enzym volgt een hyperbolisch metaalactiveringsprofiel voor het canonieke substraat en een sigmoïdaal patroon voor het niet-canonieke substraat (Fig. 1 B). Deze gegevens werden onderworpen aan Hill plot analyse (Fig. S2; en zie SI Text ), en de Hill coëfficiënt voor de metaalionen binding wordt gepresenteerd in tabel 1. Hill plot analyse onthulde de binding van een extra metaalion aan het enzym en de rol daarvan bij de splitsing van niet-canonieke sequenties. De rekrutering van een extra metaalion dichtbij of ver van de actieve site van het enzym bleek dus noodzakelijk om promiscue splitsing door het enzym te induceren. Als dat het geval is, zou mutatie van de residuen die betrokken zijn bij de coördinatie van het metaalion op de tweede plaats, de promiscue activiteit moeten opheffen, wat zou resulteren in een zeer sequentie-specifiek enzym. Wij hebben deze hypothese getest.