DISCUSSION
Citrobacter is een belangrijke oorzaak van opportunistische infecties; C. diversus wordt in verband gebracht met ongeveer 40% van de gevallen, terwijl C. freundiirepresent ongeveer 29% (11). Citrobacterspp. veroorzaken neonatale meningitis en hebben een ongebruikelijke neiging tot het veroorzaken van hersenabces (8, 14). De pathogenese van Citrobacter spp. die meningitis en hersenabces veroorzaakt is niet goed gekarakteriseerd; maar net als bij andere meningitis veroorzakende bacteriën moet penetratie van de bloed-hersenbarrière plaatsvinden. Deze studie werd ondernomen om de mogelijke interacties van C. freundii met de bloed-hersenbarrière beter te begrijpen. C. freundii werd gekozen als modelbacterie voor deze studies omdat de bacteriële genetica beter gedefinieerd is en er een genomische bibliotheek beschikbaar is voor eventuele studies naar de moleculaire basis van de invasie en replicatie van Citrobacter in HBMEC. Experimenten uitgevoerd met een cerebrospinaal vloeistof isolaat van C. diversus leverden vergelijkbare resultaten op (data niet getoond), wat suggereert dat de frequentie en het mechanisme van HBMEC invasie voor deze twee soorten gelijk kunnen zijn.
De bloed-hersenbarrière is een complexe structuur die bestaat uit het choroid plexus epitheel en het hersencapillair endotheel. De aanwezigheid van tight junctions en een lage pinocytotische activiteit van de endotheelcellen resulteert in de beperking van de passage van macro-elementen door de bloed-hersenbarrière. Op dit moment is niet bekend waar in de bloed-hersenbarrière C. freundii binnendringt, maar de plexus choroideus bleek zelden betrokken te zijn bij het ratmodel voor zuigelingen van experimentele hematogene Citrobacter meningitis (16). Bovendien bedekken endotheliale microvasculaire cellen het grootste oppervlak van de bloed-hersenbarrière, en van andere meningitis-veroorzakende bacteriën is aangetoond dat ze microvasculaire endotheliale cellen in vitro binnendringen (13, 20, 25). Daarom kozen wij HBMEC voor onze studie. Weefselkweek invasietests en TEM studies leverden bewijs dat C. freundii HBMEC binnendringt. Resultaten van invasietests uitgevoerd in aanwezigheid van verschillende eukaryote cellulaire remmers suggereren dat de invasie van C. freundii in HBMEC een microfilament-, microtubule-, de novo eiwitsynthese-, en endosoomverzuring-afhankelijk proces is. Uitgebreide invasietests toonden aan dat C. freundii kan overleven en zich gedurende langere perioden intracellulair kan vermenigvuldigen in vitro. TEM-analyses toonden aan dat de intracellulaire locatie van individuele en meervoudige C. freundii cellen zich binnen vacuole-achtige structuren met één membraan bevindt. Transwell experimenten toonden aan dat C. freundii een gepolariseerde monolayer van HBMEC kon doorkruisen, terwijl niet-invasieve E. coli dit niet kon. Bovendien tonen onze voorlopige gegevens aan dat C. freundii de bloed-hersenbarrière penetreert in het neonatale rattenmodel van experimentele hematogene meningitis (21). Alles bij elkaar suggereren deze bevindingen dat C. freundii vacuolen binnendringt, mogelijk repliceert, transcytoseert door de HBMEC, vrijkomt aan de basolaterale zijde, en zo de bloed-hersenbarrière penetreert.
Invasie van eukaryote cellen door C. freundii is gerapporteerd (22, 35). Dit is echter het eerste verslag over de invasie van HBMEC door C. freundii. Merkwaardig genoeg zijn de eukaryote vereisten voor C. freundii invasie even divers als de celtypes die C. freundii aantoonbaar invaseert. Zo blijkt de clathrin-coated pit inhibitor MDC de invasie van C. freundii te remmen in alle andere onderzochte celtypes (b.v. menselijke vasculaire, intestinale en blaasepitheelcellen) behalve, zoals in deze studie aangetoond, HBMEC. Bovendien komen andere meningitis-veroorzakende bacteriën die tot nu toe zijn gekarakteriseerd HBMEC binnen via een route die afhankelijk is van microtubuli en gevoelig is voor MDC (20, 24, 27). Van de Clathrin-gecoate putremmers MDC en ouabain is niet aangetoond dat ze alle receptoren remmen; het kan dus zijn dat de receptor die nodig is voor de invasie van C. freundii in HBMEC niet wordt beïnvloed door de remmer MDC of ouabain. Hoewel de tot nu toe verzamelde gegevens erop wijzen dat de binnendringing van C. freundii in HBMEC niet via een MDC- of ouabain-gevoelige receptor-gemedieerde route verloopt, lijkt het erop dat zowel endosoomverzuring als de novo eiwitsynthese vereist zijn. De beschikbare gegevens suggereren twee mogelijke scenario’s. Endosoomverzuring kan nodig zijn als een omgevingsprikkel voor intracellulaire bacteriële overleving. Soortgelijke vereisten zijn gekarakteriseerd voor de epitheliale invasie van Salmonella (26). Een andere mogelijkheid is dat endosoomverzuring en eiwitsynthese nodig zijn voor de scheiding van ligand-receptor complex, synthese van receptor, en/of presentatie van receptor aan HBMEC oppervlak om C. freundii invasie te laten plaatsvinden. Dit laatste scenario doet denken aan andere invasieve pathogenen, waar contact van het levensvatbare organisme nodig is voor modulatie van eukaryote celadhesiemoleculen die nodig zijn voor invasie (b.v. Streptococcus pneumoniae en de plaatjes-activerende factor receptor) (2). Experimenten zijn aan de gang in ons laboratorium om een onderscheid te maken tussen deze voorgestelde scenario’s.
Invasieproeven uitgevoerd in aanwezigheid van microtubule-inhibitoren (zowel depolymeriserende als stabiliserende middelen) verminderden aanzienlijk het vermogen van HBMEC om C. freundii op te nemen. Confocale microscopie-experimenten met anti-α-tubuline-antilichamen toonden aan dat microtubuli aggregeren nadat HBMEC in contact zijn gekomen met C. freundii. De microtubulusaggregatie was een tijdsafhankelijk proces; er werd geen aggregatie waargenomen na 5 min, weinig na 15 min, en duidelijke aggregatie werd waargenomen na 30 min incubatie van C. freundii met HBMEC. Deze microtubule-aggregatie werd geremd wanneer cellen werden behandeld met ofwel microtubule-inhibitoren of microfilament-remmende middelen. Interessant is dat het patroon van de microtubule-aggregatieverkleuring niet colokaliseerde met bacteriële binding en dat gebieden van HBMEC die geen binding met C. freundii vertoonden, ook een uitgesproken klontering van microtubuli vertoonden. Dit suggereert dat het contact van de bacterie met HBMEC de aggregatie van microtubuli globaal kan stimuleren. Of de microtubule-aggregatie het gevolg is van een afgescheiden bacteriële factor of van een paracriene reactie op bacteriële binding aan HBMEC, moet nog blijken. Bovendien kan de aggregatie van microtubuli als reactie op binding aan C. freundii in verband worden gebracht met de veronderstelde receptorpresentatie via de novo eiwitsynthese en endosoomverzuring. Eerder is aangetoond dat het transport van veel receptoren van en naar het celoppervlak afhankelijk is van microtubuli (10). Daarom is een verklaring voor het remmende effect van remmers van microtubuli op de binnendringing van C. freundii in HBMEC dat de middelen het aantal HBMEC-receptoren kunnen verminderen dat C. freundiiinvasie medieert. Experimenten zijn aan de gang om onderscheid te maken tussen deze mogelijkheden.
Microtubules hebben eerder aangetoond nodig te zijn voor invasie van vele pathogenen (b.v. Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, enteropathogene en enterohemorrhagische E. coli, en Campylobacter jejuni (4, 9, 22, 23, 29). Algemeen wordt aangenomen dat, hoewel deze pathogenen kunnen binnendringen via microtubule-afhankelijke routes, zij zich gewoonlijk niet intracellulair vermenigvuldigen (6). De gegevens die in deze studie werden verkregen uit uitgebreide invasietests en TEM-analyse suggereren dat C. freundii een uitzondering zou kunnen zijn op deze veralgemening. In tegenstelling tot wat beschreven werd voor een andere intravacuole-replicerende bacterie, Legionella pneumophila(12), waren er geen mitochondriën of ribosomen te zien in de nabijheid van de bacterie. Dit suggereert dat C. freundii deze organellen wellicht niet gebruikt om rechtstreeks energie te verkrijgen of dat rekrutering van specifieke gastheereiwitten wellicht niet vereist is voor intracellulaire overleving en proliferatie (zoals in het geval van L. pneumophila). Van bijzonder belang voor infecties van het centrale zenuwstelsel is dat andere meningitis-veroorzakende bacteriën zoals E. coli K1, GBS, en S. pneumoniae op vergelijkbare wijze BMEC zijn binnengedrongen (1, 13, 25) of zijn binnengedrongen en getranscytoseerd (20, 27); er is echter niet gevonden dat deze organismen zich in HBMEC vermenigvuldigen. Zoals hierboven beschreven, is Citrobacter meningitis gedocumenteerd vanwege de hoge frequentie van hersenabcesvorming. Of replicatie in HBMEC vacuolen uniek is voor Citrobacter en of er een correlatie is met abcesvorming moet nog worden vastgesteld.
Cytochalasine D remt C. freundii invasie in HBMEC; echter, met behulp van immunokleuring, vonden we geen detecteerbare reorganisatie van microfilamenten wanneer C. freundii interageerde met HBMEC (gegevens niet weergegeven). Bovendien remde cytochalsine D voorbehandeling van HBMEC de bacterie-afhankelijke microtubule aggregatie zoals gevisualiseerd door confocale microscopie. Er kunnen verschillende verklaringen zijn voor deze resultaten. Het effect van cytochalsine D op bacterie-afhankelijke microtubule aggregatie kan het gevolg zijn van indirecte effecten van de microfilament inhibitor op het microtubule netwerk. Er is bijvoorbeeld waargenomen dat microtubuli fungeren als verankeringsstructuren voor F-actine (28). Daarom kan verstoring van het microfilamentennetwerk het microtubuli netwerk beïnvloeden en zo indirect de microtubule-afhankelijke C. freundii invasie van HBMEC beïnvloeden. Een andere mogelijkheid is dat een actine-afhankelijke invasiestap voorafgaat aan een microtubuul-afhankelijke stap in de C. freundii invasie van HBMEC. Deze eerste stap kan resulteren in reorganisatie van microfilamenten wanneer bacteriën in eerste instantie in contact komen met HBMEC; deze gebeurtenissen kunnen echter van voorbijgaande aard zijn, en de experimentele opzet die gebruik maakt van immunofluorescentiemicroscopie kan hun optreden niet adequaat detecteren. Een vergelijkbare situatie is waargenomen bij Yersinia-invasie-gemedieerde invasie (36). Daarom, als de eerste stadia van invasie door cytochalasine D worden verhinderd, worden de volgende stadia van invasie, die van microtubule afhankelijk zijn, niet geactiveerd. Eerder is aangetoond dat actine een rol speelt bij de translocatie van actine-bindende eiwitfactoren naar de plasmamembraan en bij de cytosolische signalering (19). Bovendien remt cytochalasine D de intrede van Salmonella via verstoring van de translocatie van actine-bindende eiwitten naar de intredeplaats van de bacterie (7). Het is mogelijk dat in het geval van C. freundii invasie van HBMEC, actine microfilamenten noodzakelijk zijn voor cytosolische signalering en/of bacteriële penetratie bij de plasmamembraan, en microtubuli noodzakelijk kunnen zijn voor het transport van membraan-gebonden bacteriën van de plasmamembraan naar de basolaterale zijde (of juist dieper in de cel). Een verstoring in een van beide stadia van invasie zou dus resulteren in een “verkeersopstopping.”
Samenvattend blijkt uit de hier gepresenteerde resultaten dat C. freundii HBMEC in vitro kan binnendringen, zich binnen HBMEC kan vermenigvuldigen en transcytose kan uitvoeren. Het bepalen van de genetische basis voor deze fenotypes zal een belangrijk inzicht verschaffen in de pathofysiologie van Citrobactermeningitis en mogelijk helpen bij het ontwikkelen van nieuwe therapeutische en preventieve strategieën. Bovendien kan een uitgebreide moleculaire vergelijkende analyse van Citrobacter met andere meningitis-veroorzakende bacteriën licht werpen opCitrobacter’s unieke eigenschap van hersenabcesvorming.