Back to Basics – What is an Immunoassay – Downloadable PDF Version
What is een immunoassay of ELISA?
Immunoassays zijn snelle en nauwkeurige tests die ter plaatse en in het laboratorium kunnen worden gebruikt om specifieke moleculen te detecteren. Immunoassays steunen op het inherente vermogen van een antilichaam om zich aan de specifieke structuur van een molecule te binden. Antilichamen zijn eiwitten die door dieren worden aangemaakt als reactie op het binnendringen van een vreemde molecule (antigeen) in het lichaam. Antilichamen worden aangetroffen in bloed en weefselvloeistoffen en zullen zich aan het antigeen binden wanneer dit wordt aangetroffen. Omdat antilichamen zijn ontwikkeld voor de specifieke driedimensionale structuur van een antigeen, of analyt, zijn zij zeer specifiek en zullen zij zich alleen aan die structuur binden. Eenmaal gezuiverd uit het bloed zijn monoklonale en polyklonale antilichamen ideale assayreagentia om specifieke doelmoleculen op te sporen en te controleren met beperkte interferenties van andere stoffen. Vier typische ELISA-formaten zijn: antilichaam sandwich immunoassays, antigen-down immunoassays, competitieve remmingsassays en snelle assays.
Antilichaam sandwich immunoassay
In een typische antilichaam sandwich immunoassay, wordt een monoklonaal antilichaam geadsorbeerd op een plastic microtiterplaat. Wanneer het testmonster aan de plaat wordt toegevoegd, zal het antilichaam op de plaat het doelantigeen van het monster binden en het in de plaat vasthouden. Wanneer in de volgende stap een polyklonaal antilichaam wordt toegevoegd, bindt dit ook aan het doelantigeen (dat reeds aan het monoklonale antilichaam op de plaat is gebonden), waardoor een antigeen-“sandwich” wordt gevormd tussen de twee verschillende antilichamen.
– Stap 1: Monoklonale antilichamen worden geadsorbeerd aan de well van een plastic microtiterplaat met coatingbuffer (er wordt geen monster toegevoegd).
– Stap 2: Toevoeging van een monster (zoals menselijk bloed, voldoende verdund) aan de well van de microtiterplaat. Het doelantigeen bindt zich aan het op de plaat geadsorbeerde antilichaam, waardoor het antigeen in de well wordt vastgehouden.
– Stap 3: Binding van een enzymegeconjugeerd polyklonaal antilichaam aan het doelantigeen (gebonden aan het monoklonale antilichaam op de plaat), waardoor een antigeen-“sandwich” wordt gevormd tussen de twee verschillende antilichamen.
– Stap 4: Toevoeging van een colorimetrisch substraat voor detectie van de enzyme-geconjugeerde polyklonale antilichamen genereert een kleursignaal dat evenredig is aan de hoeveelheid doelantigeen in het oorspronkelijke monster dat aan de plaat is toegevoegd.
Antigen-Down (immuniteitstest) immunoassay
In een antigen-Down (immuniteitstest) immunoassay wordt een coating van de te analyseren stof gebruikt om antilichamen in een monster aan zich te binden. Wanneer het monster wordt toegevoegd (zoals humaan serum), wordt het antigeen op de plaat gebonden door antilichamen (bijvoorbeeld IgE) uit het monster, die vervolgens in de well worden vastgehouden. Vervolgens wordt een soortspecifiek antilichaam (anti-humaan IgE bijvoorbeeld), gelabeld met HRP, toegevoegd, dat zich bindt aan het antilichaam dat aan het antigeen op de plaat is gebonden. Hoe hoger het signaal, hoe meer antilichamen er in het monster aanwezig zijn. Antigen-down (immuniteitstest) assays kunnen als snelle tests worden geconfigureerd en worden vaak gebruikt om allergieaandoeningen te diagnosticeren – routinematig wordt het bloed van een patiënt getest tegen verschillende allergenen om te zien of de persoon antilichamen tegen dat allergeen heeft.
Competitieve inhibitie-immunoassay
Naast het monoklonaal-polyklonale (Mo-Po) antilichaam-sandwichformaat, zijn veel immunoassays gestructureerd in een concurrerend inhibitieformaat. Competitieve remmingsassays worden vaak gebruikt om kleine analyten te meten, omdat voor competitieve remmingsassays slechts de binding van één antilichaam nodig is in plaats van twee, zoals bij standaard ELISA-formaten. Vanwege de grote kans op sterische hinder die optreedt wanneer twee antilichamen tegelijkertijd aan een klein molecuul proberen te binden, is een sandwich assay-formaat wellicht niet haalbaar. Daarom verdient een competitieve remmingstest de voorkeur.
In een sequentiële competitieve remmingstest worden het monster en de geconjugeerde analyt in stappen toegevoegd, zoals in een sandwich-test, terwijl in een klassieke competitieve remmingstest deze reagentia tegelijk worden geïncubeerd. In een sequentiële competitieremmingstest wordt een monoklonaal antilichaam gecoat op een 96-well microtiterplaat. Wanneer het monster wordt toegevoegd, vangt het MoAb vrije analyt uit het monster. In de volgende stap wordt een bekende hoeveelheid analyt, gelabeld met biotine of HRP, toegevoegd. Het gelabelde analyt zal dan ook trachten te binden aan het MoAb dat aan de plaat is geadsorbeerd, maar het gelabelde analyt wordt geremd bij binding aan het MoAb door de aanwezigheid van eerder gebonden analyt uit het monster. Dit betekent dat het gelabelde analyt niet door het monoklonaal op de plaat zal worden gebonden als het monoklonaal reeds ongelabeld analyt uit het monster heeft gebonden. De hoeveelheid ongelabeld analyt in het monster is omgekeerd evenredig met het signaal dat door het gelabelde analyt wordt opgewekt. Hoe lager het signaal, hoe meer ongelabeld analyt er in het monster aanwezig is. Er kan een standaardcurve worden gemaakt met seriële verdunningen van een standaard van ongelabeld analyt. De volgende monsterwaarden kunnen dan van de standaardcurve worden afgelezen, zoals dat ook gebeurt bij sandwich-ELISA’s. Bij de klassieke competitieremmingstest moeten gelabelde (geconjugeerde analyt) en ongelabelde analyt (van het monster) tegelijk worden toegevoegd. Zowel het gelabelde als het ongelabelde analyt concurreren dan gelijktijdig om de bindingsplaats op het monoklonale vangstantilichaam op de plaat. Net als bij de sequentiële competitieve inhibitie is het gekleurde signaal omgekeerd evenredig met de concentratie van ongelabeld doelanalyt in het monster. Detectie van gelabeld analyt kan plaatsvinden met behulp van een peroxidasesubstraat zoals TMB, dat op een microtiterplaatlezer kan worden afgelezen.
Rapid Immunoassay
Naast microtiterplaten worden immunoassays ook als snelle tests uitgevoerd, zoals een zwangerschapstest thuis. Net als bij microtiterplaten maken snelle tests gebruik van antilichamen om met antigenen te reageren en kunnen ze worden ontwikkeld als MoAb-PoAb sandwich-formaten, competitieve inhibitie-formaten en antigeen-down-formaten. Bij een snelle test zijn het antilichaam en de antigeenreagentia gebonden aan poreuze membranen, die reageren met positieve monsters terwijl overtollige vloeistoffen naar een niet-reactief deel van het membraan worden gekanaliseerd. Snelle immunoassays bestaan gewoonlijk in 2 configuraties: een laterale flowtest waarbij het monster gewoon in een putje wordt geplaatst en de resultaten onmiddellijk worden afgelezen; en een doorstroomsysteem, waarbij het monster in een putje wordt geplaatst, het putje wordt gewassen en ten slotte een conjugaat van analietcolloïdaal goud wordt toegevoegd en het resultaat na enkele minuten wordt afgelezen. Per strip of cassette wordt één monster getest. Omdat snelle tests sneller zijn dan microtiterplaatanalyses, weinig monsterverwerking vergen, vaak goedkoper zijn en ja/nee-antwoorden opleveren zonder een instrument te gebruiken, worden zij vaak in het veld gebruikt door niet-laboratoriumpersoneel dat hele monsters test. Snelle immunoassays zijn echter niet zo gevoelig en kunnen niet worden gebruikt om een analyt nauwkeurig te kwantificeren (zelfcontrole van bloedglucosespiegels door diabetici wordt beschouwd als kwantitatieve snelle test, maar voor deze tests wordt geen immunoassaytechnologie gebruikt). Alle snelle immunoassay-tests kunnen worden omgezet in een microtiterplaat-test, maar niet alle microtiterplaat-tests kunnen worden omgezet in een snelle test.
