Omstreeks 1000 v. Chr. vestigde zich een golf van immigranten in het dal van de Tiber tot aan de Adriatische Zee, en ook in de omgeving van Assisi. Dit waren de Umbriërs, die in kleine versterkte nederzettingen op hoge grond woonden. Vanaf 450 v. Chr. werden deze nederzettingen geleidelijk aan overgenomen door de Etrusken. De Romeinen namen Midden-Italië in handen na de Slag bij Sentinum in 295 v. Chr. Zij bouwden het bloeiende municipium Asisium op een reeks terrassen op de Monte Subasio. Romeinse overblijfselen zijn nog steeds te vinden in Assisi: stadsmuren, het forum (nu Piazza del Comune), een theater, een amfitheater en de tempel van Minerva (nu omgevormd tot de kerk van Santa Maria sopra Minerva). In 1997 werden ook de overblijfselen van een Romeinse villa ontdekt met verschillende goed bewaarde kamers met fresco’s en mozaïeken in een staat die zelden wordt aangetroffen buiten plaatsen zoals Pompei.
In 238 AD werd Assisi bekeerd tot het christendom door bisschop Rufino, die werd gemarteld in Costano. Volgens de traditie rusten zijn stoffelijke resten in de kathedrale kerk van San Rufino in Assisi.
De Ostrogoten van koning Totila verwoestten in 545 het grootste deel van de stad. Assisi kwam vervolgens onder de heerschappij van de Longobarden als onderdeel van het Longobardische en vervolgens Frankische hertogdom Spoleto.
De bloeiende gemeente werd in de 11e eeuw een onafhankelijke Ghibellijnse gemeente. Tijdens een van deze gevechten, de slag bij Ponte San Giovanni, werd Francesco di Bernardone (de heilige Franciscus van Assisi) gevangen genomen, waarmee de gebeurtenissen in gang werden gezet die hem er uiteindelijk toe brachten als bedelaar te leven, de wereld af te zweren en de orde van de minderbroeders op te richten.
De stad, die binnen de grenzen van de Romeinse muren was gebleven, begon zich in de 13e eeuw buiten deze muren uit te breiden. In deze periode stond de stad onder pauselijke jurisdictie. De Rocca Maggiore, de keizerlijke vesting op de top van de heuvel boven de stad, die in 1189 door het volk was geplunderd, werd in 1367 herbouwd op bevel van de pauselijke legaat, kardinaal Gil de Albornoz.
In het begin viel Assisi onder de heerschappij van Perugia en later onder verschillende despoten, zoals de geluksvogel Biordo Michelotti, Gian Galeazzo Visconti en zijn opvolger Francesco I Sforza, hertogen van Milaan, Jacopo Piccinino en Federico II da Montefeltro, heer van Urbino. De stad raakte in diep verval door de pest van de Zwarte Dood in 1348.
De stad kwam weer onder pauselijke jurisdictie onder het bewind van Paus Pius II (1458-1464).
In 1569 werd begonnen met de bouw van de Basiliek van Santa Maria degli Angeli. Tijdens de Renaissance en in latere eeuwen bleef de stad zich rustig ontwikkelen, zoals de 17de-eeuwse palazzi van de Bernabei en Giacobetti getuigen.
Het huidige bedevaartsoord Assisi is in de legende verbonden met zijn geboortezoon, Franciscus. De zachtaardige heilige stichtte de Franciscaanse orde en deelt de eer met de heilige Catharina van Siena als patroonheilige van Italië. Hij wordt door velen, zelfs niet-christenen, herinnerd als een liefhebber van de natuur (zijn preek voor een publiek van vogels is een van de legendes van zijn leven).
Assisi werd getroffen door twee verwoestende aardbevingen, die Umbrië in september 1997 deden schudden. Maar het herstel en de restauratie zijn opmerkelijk geweest, hoewel er nog veel moet gebeuren. Veel historische bezienswaardigheden liepen enorme schade op, maar de grootste attractie, de Basilica di San Francesco, werd minder dan 2 jaar later heropend.