Eines der wichtigsten Verfahren in der Virologie ist die Messung des Virustiters – der Konzentration von Viren in einer Probe. Eine weit verbreitete Methode zur Bestimmung der Menge infektiöser Viren ist der Plaque-Assay. Diese Technik wurde zunächst entwickelt, um die Titer von Bakteriophagenbeständen zu berechnen. Renato Dulbecco modifizierte dieses Verfahren 1952 für den Einsatz in der Tiervirologie, und seither wird es zur zuverlässigen Bestimmung der Titer vieler verschiedener Viren verwendet.
Zur Durchführung eines Plaque-Assays werden 10-fache Verdünnungen einer Virusbrühe hergestellt, und 0,1 ml Aliquots werden auf empfängliche Zellmonolayer beimpft. Nach einer Inkubationszeit, die es dem Virus ermöglicht, sich an die Zellen zu heften, werden die Monolayer mit einem Nährmedium bedeckt, das eine Substanz, in der Regel Agar, enthält, die die Bildung eines Gels bewirkt. Wenn die Platten bebrütet werden, setzen die ursprünglich infizierten Zellen virale Nachkommen frei. Die Ausbreitung der neuen Viren wird durch das Gel auf benachbarte Zellen beschränkt. Infolgedessen bildet jedes infektiöse Partikel eine kreisförmige Zone mit infizierten Zellen, die als Plaque bezeichnet wird. Schließlich wird die Plaque groß genug, um mit dem bloßen Auge sichtbar zu sein. Um den Kontrast zwischen den lebenden Zellen und den Plaques zu verstärken, werden häufig Farbstoffe verwendet, die lebende Zellen anfärben. Nur Viren, die eine sichtbare Schädigung von Zellen verursachen, können auf diese Weise untersucht werden. Ein Beispiel für Plaques, die von Polioviren auf einer Monolage von HeLa-Zellen gebildet werden, ist links abgebildet. In diesem Bild wurden die Zellen mit Kristallviolett angefärbt, und die Plaques sind gut sichtbar, wo die Zellen durch die Virusinfektion zerstört wurden.
Der Titer eines Virusbestandes kann in Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Milliliter berechnet werden. Um den Virustiter zu bestimmen, werden die Plaques gezählt. Um den Fehler zu minimieren, werden nur Platten gezählt, die zwischen 10 und 100 Plaques enthalten, je nach Größe der Zellkulturplatte, die verwendet wird. Statistische Grundsätze besagen, dass bei der Zählung von 100 Plaques der Probentiter um plus/minus 10 % schwanken wird. Um die Genauigkeit zu erhöhen, wird jede Verdünnung in zweifacher Ausführung ausgeplattiert. In dem unten gezeigten Beispiel befinden sich 17 Plaques auf der Platte aus der 10-6-Verdünnung. Der Titer der Virusbrühe beträgt daher 1,7 x 108 PFU/ml.
Nächste Betrachtung: Wie kann der Plaque-Assay zur Herstellung klonaler Virusbrühen verwendet werden, ein Schritt, der für die Untersuchung der Virusgenetik unerlässlich ist.
Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 273-279