MTT, ein gelbes Tetrazol, wird in lebenden Zellen zu violettem Formazan reduziert. Eine Solubilisierungslösung (in der Regel entweder Dimethylsulfoxid, eine angesäuerte Ethanollösung oder eine Lösung des Detergens Natriumdodecylsulfat in verdünnter Salzsäure) wird hinzugefügt, um das unlösliche violette Formazanprodukt in eine farbige Lösung aufzulösen. Die Absorption dieser gefärbten Lösung kann durch Messung bei einer bestimmten Wellenlänge (in der Regel zwischen 500 und 600 nm) mit einem Spektrophotometer quantifiziert werden. Der Grad der Lichtabsorption hängt vom Grad der Formazankonzentration ab, die sich im Inneren der Zelle und auf der Zelloberfläche angesammelt hat. Je höher die Formazankonzentration ist, desto tiefer ist die violette Färbung und desto höher ist die Absorption.
XTT (2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilid) wurde als Ersatz für MTT vorgeschlagen, um eine höhere Empfindlichkeit und einen größeren dynamischen Bereich zu erzielen. Der gebildete Formazan-Farbstoff ist wasserlöslich, so dass ein abschließender Solubilisierungsschritt vermieden werden kann.
Wasserlösliche Tetrazoliumsalze sind neuere Alternativen zu MTT: Sie wurden durch die Einführung positiver oder negativer Ladungen und Hydroxygruppen in den Phenylring des Tetrazoliumsalzes oder besser mit direkt oder indirekt an den Phenylring angefügten Sulfonatgruppen entwickelt.
MTS (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-Tetrazolium) erzeugt in Gegenwart von Phenazinmethosulfat (PMS) ein Formazanprodukt, das in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ein Absorptionsmaximum bei 490 nm aufweist. Der MTS-Assay wird häufig als „einstufiger“ MTT-Assay bezeichnet, der den Vorteil bietet, dass das Reagenz direkt in die Zellkultur gegeben wird, ohne die beim MTT-Assay erforderlichen Zwischenschritte. Diese Bequemlichkeit macht den MTS-Assay jedoch anfällig für farbmetrische Interferenzen, da die intermittierenden Schritte beim MTT-Assay Spuren farbiger Verbindungen entfernen, während diese beim einstufigen MTS-Assay in der Mikrotiterplatte verbleiben. Bei der Verwendung dieses Assays sind Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, um die Genauigkeit zu gewährleisten, und es gibt gute Argumente dafür, die MTS-Ergebnisse durch qualitative Beobachtungen unter dem Mikroskop zu bestätigen. (Dies ist jedoch bei allen kolorimetrischen Assays ratsam.)
WSTs (wasserlösliche Tetrazoliumsalze) sind eine Reihe anderer wasserlöslicher Farbstoffe für MTT-Assays, die entwickelt wurden, um unterschiedliche Absorptionsspektren der gebildeten Formazane zu erzeugen. WST-1 und insbesondere WST-8 (2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-Tetrazolium) haben gegenüber MTT den Vorteil, dass sie außerhalb der Zellen reduziert werden, mit dem Elektronenvermittler PMS kombiniert werden und ein wasserlösliches Formazan ergeben. Schließlich können WST-Assays (1) direkt abgelesen werden (im Gegensatz zu MTT, das einen Auflösungsschritt benötigt), (2) liefern ein effektiveres Signal als MTT und (3) verringern die Toxizität für die Zellen (im Gegensatz zu zellpermeablem MTT und seinem unlöslichen Formazan, das sich in den Zellen anreichert).