Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cinnamaldehyde

Auswahl von Enzymen für die Zimtaldehyd-Biosynthese

Zimtaldehyd kann aus L-Phenylalanin synthetisiert werden und seine Biosynthese erfordert drei enzymatische Reaktionen: (i) Desaminierung von l-Phenylalanin zu Zimtsäure durch Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL, EC 4.3.1.24), (ii) Säure-Thiol-Bindung von Zimtsäure zu Cinnamoyl-CoA durch 4-Cumarat:CoA-Ligase (4CL, EC 6.2.1.12) und (iii) die Reduktion von Cinnamoyl-CoA zu Cinnamaldehyd durch Cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR, EC 1.2.1.44) (Abb. 1a). PAL ist ein ubiquitäres Enzym, das in vielen Pflanzen, Pilzen und einigen Bakterien vorkommt und je nach Herkunft des Enzyms unterschiedliche Aktivitäten und Spezifitäten aufweist. Wir haben zwei PAL-Enzyme, eines aus der Pflanze Arabidopsis thaliana (AtPAL) und ein anderes aus dem Bakterium Streptomyces maritimus (SmPAL), auf ihre Eignung zur Herstellung von Zimtsäure in E. coli untersucht. Im Falle von AtPAL gibt es vier Isomere, darunter AtPAL1 bis AtPAL4, und es wurde bereits berichtet, dass die meisten von ihnen (AtPAL1, 2 und 4) ähnlich höhere Aktivitäten als AtPAL3 gegenüber l-Phenylalanin als Substrat aufweisen, so dass wir AtPAL1 als Vertreter aus pflanzlichen Quellen ausgewählt haben. Ihre kinetischen Konstanten (Km) wurden mit 68 bzw. 23 μM angegeben. Jedes His-markierte PAL-Enzym wurde in E. coli BL21(DE3) hergestellt und nach den in „Methoden“ beschriebenen Verfahren gereinigt. Beide Enzyme, AtPAL1 (78 kDa) und SmPAL (56 kDa), wurden erfolgreich gereinigt (Additional file 1: Abbildung S1). Obwohl das Expressionsniveau von AtPAL1 nicht so hoch war, dass die Bande in den Spuren 1 und 2 der SDS-PAGE nicht zu sehen war, konnte die Bande von AtPAL1 nach der Affinitätssäulenchromatographie in der Spur 3, in der das konzentrierte Eluat geladen wurde, deutlich gesehen werden. Die äquivalente Molarität jedes gereinigten PAL-Enzyms wurde mit der gleichen Menge an l-Phenylalanin (als Substrat) inkubiert, und der Produktionstiter der Zimtsäure wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) quantifiziert (Additional file 2: Abbildung S2). Wie in Abb. 1b gezeigt, wies SmPAL eine deutlich höhere Aktivität auf (21-fach bei der 30 °C-Reaktion und 27-fach bei der 37 °C-Reaktion) als AtPAL1.

Wir untersuchten auch zwei verschiedene 4CL-Enzyme, eines aus Streptomyces coelicolor (ScCCL) und ein anderes aus A. thaliana (At4CL), auf ihre Eignung zur Umwandlung von Zimtsäure zu Zimtaldehyd in E. coli. Im Fall von At4CL ist bekannt, dass es 14 mutmaßliche Isoformen gibt (At4CL1-At4CL14). Von den 14 Isoformen haben At4CL1-3 ähnliche Aktivitäten gegenüber Cinnamat, während die übrigen Isoformen dies nicht tun. Daher haben wir At4CL1 als Vertreter ausgewählt. Außerdem verwendeten wir das CCR-Enzym aus A. thaliana (AtCCR1) für die Umwandlung von Cinnamoyl-CoA in Cinnamaldehyd. Jedes 4CL-Enzym (At4CL1 und ScCCL ) wurde in Kombination mit dem CCR-Enzym aus A. thaliana (AtCCR) getestet. Alle Enzyme wurden erfolgreich mit hoher Reinheit gereinigt (Additional file 1: Abbildung S1). Um die enzymatischen Aktivitäten von At4CL1 und ScCCL zu vergleichen, wurden zwei Reaktionen, (i) At4CL1 mit AtCCR und (ii) ScCCL mit AtCCR, vorbereitet und mit Zimtsäure als Substrat gemischt. Nach Inkubation bei 30 und 37 °C wurde der Zimtaldehyd-Titer mittels HPLC analysiert. Wie in Abb. 1c gezeigt, führte die Kombination aus ScCCL und AtCCR zu einem höheren Produktionstiter von Zimtaldehyd (4,4-fach bei 30 °C und 10,4-fach bei 37 °C) als die Kombination aus At4CL1 und AtCCR. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse konstruierten wir das Zimtaldehyd-Biosynthesesystem in E. coli wie unten beschrieben unter Verwendung der folgenden Enzyme: SmPAL, ScCCL und AtCCR.

Konstruktion des Zimtaldehyd-Biosynthesewegs in E. coli

Um Zimtaldehyd in E. coli zu produzieren, wurden die Gene SmPAL, ScCCL und AtCCR in der folgenden Reihenfolge in pTrc99A kloniert: SmPAL, ScCCL und AtCCR (was pHB-CAD ergibt) (Abb. 2a). E. coli W3110, das pHB-CAD beherbergt, wurde bei zwei verschiedenen Temperaturen (30 und 37 °C) kultiviert, um die optimale Temperatur für die Zimtaldehydproduktion zu finden. Die Expression der Enzyme wurde mittels SDS-PAGE und anschließender Western-Blot-Analyse, wie in „Methoden“ beschrieben, analysiert. Bei beiden Temperaturen wurden alle Enzyme gut exprimiert und waren gut löslich (Abb. 2b). Obwohl jedes Enzym in unterschiedlichem Maße exprimiert wurde, war die Expression jedes Enzyms bei 37 °C geringfügig besser als bei 30 °C. Auch die Analyse des im Kulturmedium produzierten Zimtaldehyd-Titers mittels HPLC ergab, dass der Zimtaldehyd-Produktionstiter bei 37 °C 4,5-mal höher war als bei 30 °C (Abb. 2c). Wir vermuteten, dass der höhere Produktionstiter von Zimtaldehyd bei 37 °C durch die erhöhte Expression aller biosynthetischen Enzyme bei 37 °C aktiv verursacht wurde, obwohl diese Enzyme auch bei 30 °C aktiv sind. Im Folgenden wurden alle Kultivierungen zur Herstellung von Zimtaldehyd bei 37 °C durchgeführt.

Strain-Engineering zur Erhöhung des intrazellulären Pools von l-Phenylalanin

Für die Biosynthese von Zimtaldehyd ist l-Phenylalanin als essentieller Vorläufer erforderlich. Um die Zimtaldehyd-Produktion zu steigern, ist es daher wünschenswert, den intrazellulären Pool von L-Phenylalanin zu erhöhen. Zu diesem Zweck haben wir E. coli auf rationale Weise so umgestaltet, dass es mehr L-Phenylalanin produziert. Anhand der verfügbaren Informationen über den Stoffwechsel und die Regulierung haben wir E. coli W3110 wie folgt verändert: (i) Deletion des crr-Gens, das für das EIIAGlc-Protein kodiert, das mit dem glukosespezifischen Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase-System (PTS) zusammenhängt, um die Substrataufnahmerate zu moderieren, den Metabolitenüberlauf zu verringern und die Vorläuferanreicherung zu verbessern, (ii) Deletion des tyrR-Gens, um die strenge Regulierung des TyrR-Regulons, das Gene für die Synthese aromatischer Aminosäuren (AAA) enthält, zu erleichtern, (iii) Deletion der Gene trpE (Anthranilat-Synthase-Komponente) und tyrA, um den Verlust des Kohlenstoffflusses in konkurrierende Wege (Biosynthese von L-Tryptophan und L-Tyrosin) zu verhindern, und (iv) Deletion des Gens pykA (Pyruvat-Kinase A) zur Anreicherung der Vorstufe und zum Ausgleich des Flusses zwischen Wachstum und L-Phenylalanin-Produktion (Abb. 3). 3). Auf der Grundlage des obigen Schemas wurden fünf aufeinanderfolgende Knockout-Mutanten von E. coli W3110 entwickelt (YHP01-YHP05) (Tabelle 1).

Zunächst wurde ein glucosespezifisches Phosphoenolpyruvat-PTS durch Deletion des crr-Gens in E. coli W3110 Stamm inaktiviert, wodurch E. coli YHP01 entstand. Obwohl dadurch das Hauptsystem für die Glukose-Internalisierung unterbrochen wird, kann YHP01 weiterhin in definierten Medien wachsen, die Glukose als einzige Kohlenstoffquelle enthalten, da das Mannose-spezifische PTS und die Galaktose-Permease weiterhin Glukose in das Zytoplasma internalisieren können. Die Umgehung des PTS führt zu einem erhöhten Pool an Phosphoenolpyruvat (PEP), das letztlich die Synthese von l-Phenylalanin erleichtert. Als nächstes haben wir das tyrR-Gen in YHP01 entfernt, um den Stamm YHP02 zu erhalten. Das TyrR-Protein ist ein Regulator des TyrR-Regulons, das acht Gene enthält, die an der Biosynthese von AAA beteiligt sind. Seine Deletion kann auch den L-Phenylalanin-Pool erhöhen, indem die strenge Regulierung von Genen, die mit der AAA-Synthese zusammenhängen, gelockert wird. Als Nächstes wurden die Gene trpE und tyrA, beginnend mit dem Stamm YHP02, sequentiell entfernt, so dass die Stämme YHP03 und YHP04 entstanden. Im Biosyntheseweg der AAAs gibt es einen letzten Verzweigungspunkt, an dem Chorismat durch die Enzyme PheA, TrpE bzw. TyrA in l-Phenylalanin, l-Tryptophan oder l-Tyrosin umgewandelt werden kann. Die Deletionen der trpE- und tyrA-Gene können den Verlust von Kohlenstoff in konkurrierende Wege für die Biosynthese von l-Tryptophan und l-Tyrosin verhindern. Schließlich haben wir das pykA-Gen in YHP04 entfernt, um den Stamm YHP05 zu erhalten. Das pykA-Gen kodiert die Pyruvatkinase A (PykA), die den zweiten PEP-verbrauchenden Schritt darstellt. Durch Deletion des pykA-Gens kann mehr PEP im Shikimat-Stoffwechselweg verwendet und folglich eine größere Menge an L-Phenylalanin produziert werden. Bei jedem Stamm (YHP01-YHP05) wurde die Deletion der Gene durch PCR und Agarosegel-Elektrophorese verifiziert (Additional file 3: Abbildung S3).

Alle manipulierten E. coli-Stämme, einschließlich YHP01-YHP05 und des elterlichen E. coli W3110, wurden in Schüttelkolben mit halb definierten Medien kultiviert und das Zellwachstum und die L-Phenylalanin-Produktion wurden verglichen. Nach einer Kultivierungsdauer von 48 Stunden wuchsen alle manipulierten Stämme etwas besser als der Stamm W3110; insbesondere der Stamm E. coli YHP05 wies die höchste Zelldichte auf (Abb. 4a). In einer früheren Studie wurde auch beobachtet, dass die Inaktivierung der PTS- und Pyk-Isoenzyme den Kohlenstofffluss zur Biomassebildung erhöht, da durch die verringerte Glukoseaufnahme und den verringerten Katabolismus geringere Mengen an Intermediärmetaboliten erhalten bleiben. Wir analysierten auch den Produktionstiter von l-Phenylalanin im Kulturüberstand mittels HPLC. Im elterlichen W3110-Stamm betrug der Produktionstiter von l-Phenylalanin 0,24 g/L, aber der Titer von l-Phenylalanin wurde in den veränderten E. coli-Stämmen allmählich erhöht (Abb. 4a). E. coli YHP05, bei dem die Gene crr, tyrR, trpE, tyrA und pykA deletiert wurden, wies den höchsten Titer der L-Phenylalanin-Produktion auf (0,52 g/L), der 2,2-mal höher war als der des elterlichen E. coli W3110. Daher entschieden wir uns, den E. coli-Stamm YHP05 für die weitere Entwicklung zu verwenden.

Plasmid-basiertes Überexpressionssystem zur Erhöhung des intrazellulären Pools von l-Phenylalanin

Ausgehend vom E. coli-Stamm YHP05 wurde die Produktion von l-Phenylalanin durch plasmidbasierte Genüberexpression weiter verbessert. Die Rückkopplungshemmung im l-Phenylalanin-Syntheseweg durch Shikimat und l-Phenylalanin wurde durch die Überexpression von Isoenzymen oder die Einführung von Mutationen in Enzymen, die am Shikimat-Weg beteiligt sind, wie folgt verringert: (i) Überexpression des 3-Desoxy-d-arabinoheptulosonat-7-phosphat (DAHP)-Synthase-Gens, das in aroG mit Engineering (AroG8/15) kodiert wird, (ii) Überexpression der ydiB- und aroK-Gene, die für Shikimat-Dehydrogenase und Shikimat-Kinase kodieren, um den Kohlenstofffluss in den Shikimat-Weg zu erhöhen, (iii) Überexpression des pheA-Gens, das für CHA-Mutase/Prephenat-Dehydratase kodiert, mit Engineering zur Verbesserung der Substratbindungsaffinität (PheAfbr, dm), und (iv) Überexpression der Gene galP (Galaktose-Permease) und glk (Glucokinase) zur Erleichterung der Glukoseaufnahme (Additional file 4: Abbildung S4).

Zur Verringerung der Rückkopplungshemmung wurde zunächst das Plasmid pTac15kG konstruiert, das das manipulierte aroG8/15-Gen enthält. AroG ist das wichtigste Enzym, das an der Synthese von DAHP beteiligt ist, aber AroG wird vollständig durch l-Phenylalanin (bis zu 0,1 mM) gehemmt. Es ist bekannt, dass die Einführung von zwei Mutationen (D146N und A202T) zu einer Resistenz gegen die Rückkopplungshemmung führt, ohne die hohe spezifische Aktivität (AroG8/15) zu beeinträchtigen, daher haben wir dieses mutierte AroG8/15-Enzym überexprimiert. Anschließend wurden zwei Plasmide (pTac15kGB und pTac15kGBK) konstruiert, um die Gene ydiB und aroK zusammen mit dem aroG8/15-Gen zu überexprimieren. Der Stoffwechselfluss zum Shikimat-Stoffwechselweg kann durch die Überexpression von Shikimat-Dehydrogenase (YdiB) und Shikimat-Kinase (AroK) erhöht werden. Außerdem wurde das Plasmid pTac15kGBKA konstruiert, um das pheA-Gen zu überexprimieren, das für Chorismatmutase/Prephenatdehydratase mit Mutationen kodiert. In diesem Konstrukt haben wir nur die ersten 300 Aminosäuren des Wildtyps von PheA (PheAfbr) amplifiziert, was die regulatorische Domäne ausschließt; daher wird PheAfbr durch Rückkopplungshemmung nur schwach beeinflusst. Da PheAfbr einen höheren Km-Wert als Wildtyp-PheA hat, was seine geringere Bindungsaffinität zum Substrat widerspiegelt, führten wir zwei Mutationen (E159A und E232A) in PheAfbr ein, um seine Substratbindungsaffinität zu erhöhen, was zu PheAfbr, dm führte. Schließlich wurde ein pYHP-Plasmid konstruiert, um zusätzlich die Gene galP und glk zu überexprimieren, die für Galaktose-Permease bzw. Glucokinase kodieren. Beide Enzyme erleichtern die Aufnahme von Glukose.

Nach der Konstruktion von fünf Plasmiden, darunter pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBKA und pYHP (Tabelle 1), wurde jedes Plasmid in E. coli YHP05 transformiert. Nach einer 48-stündigen Kultivierung in Schüttelkolben mit semidefinierten Medien wurden das Zellwachstum und der Produktionstiter von l-Phenylalanin analysiert. Alle Zellen wuchsen gut, und insbesondere E. coli YHP05 mit pYHP wies eine geringfügig höhere Zelldichte (OD600 = 9,76) auf als die anderen (Abb. 4b). Wir analysierten auch den Produktionstiter von l-Phenylalanin im Kulturüberstand mittels HPLC. Die Überexpression des aroG8/15-Gens (pTac15kG) führte zu einem signifikanten Anstieg der l-Phenylalanin-Produktion (2,25 g/L) im Vergleich zu YHP05, das kein Plasmid enthielt (0,52 g/L) (Abb. 4b). Die anschließende Überexpression anderer Gene führte zu einem seriellen Anstieg des Produktionstiters von l-Phenylalanin, und E. coli YHP05 mit pYHP wies den höchsten l-Phenylalanin-Produktionstiter auf (3,91 g/L) (Abb. 4b). Die Wirkung des pYHP-Plasmids führte zu einer signifikanten Steigerung der L-Phenylalanin-Produktion um das 16,4- bzw. 7,5-fache. Bei der Kultivierung von E. coli YHP05 mit pYHP betrug die Ausbeute an L-Phenylalanin in Bezug auf Glukose 0,270 g/g und die Produktivität 0,082 g/L/h (Zusatzdatei 5: Abbildung S5). In dem gentechnisch veränderten E. coli YHP05, der pYHP enthält, wurde der L-Phenylalanin-Pool also deutlich verbessert. Liu et al. berichteten zuvor über eine Produktion von l-Phenylalanin in E. coli von bis zu 47 g/L. Dieser Rekord wurde jedoch in der Fed-Batch-Kultivierung (im 15-Liter-Maßstab) erreicht, und sie verwendeten die Koexpression des l-Phenylalanin-Transporters (YddG) für die effiziente Produktion von l-Phenylalanin im Kulturmedium. In unserer Arbeit haben wir den YddG nicht eingesetzt, weil das Ziel unserer Arbeit nicht die Produktion von l-Phenylalanin, sondern die Produktion von Zimtaldehyd war. Obwohl der Titer von l-Phenylalanin, der in unserer Arbeit erreicht wurde, nicht der höchste war, dachten wir, dass er hoch genug für die Produktion von Zimtaldehyd war. Daher beschlossen wir, diesen manipulierten Stamm für die Produktion von Zimtaldehyd zu verwenden.

Zimtaldehyd-Produktion im manipulierten E. coli

Unter Verwendung des manipulierten E. coli YHP05, der pYHP beherbergt, untersuchten wir zunächst die Produktion von Zimtsäure. Für dieses Experiment wurde das Plasmid pHB-CA konstruiert, das das SmPAL-Gen unter dem IPTG-induzierbaren trc-Promotor enthält (Tabelle 1). E. coli YHP05, das sowohl pHB-CA als auch pYHP enthält, wurde 48 Stunden lang in Kolben kultiviert, und der Produktionstiter von Zimtsäure wurde analysiert. E. coli YHP05 und E. coli W3110, das pHB-CA (ohne pYHP) enthält, wurden ebenfalls als Kontrollen untersucht. Die Wachstumsmuster aller Zellen waren ähnlich (Abb. 5a), und E. coli W3110 und YHP05, die pHB-CA enthielten, produzierten 79 bzw. 108 mg/L Zimtsäure (Abb. 5b). E. coli YHP05, das sowohl pHB-CA als auch pYHP enthält, wies einen deutlich höheren Produktionstiter (287 mg/L) auf, der 3,6- bzw. 2,7-mal höher war als der von E. coli W3110 und YHP05, die pHB-CA enthalten (Abb. 5b). Soweit wir wissen, war dieser Produktionstiter auch 1,5-mal höher als der höchste in E. coli gemeldete Wert (186 mg/L). Dieses Ergebnis deutet eindeutig darauf hin, dass die Erhöhung der Menge an L-Phenylalanin im manipulierten E. coli-Stamm positiv zur Steigerung der Zimtsäureproduktion beiträgt.

Als Hauptziel untersuchten wir die Zimtaldehyd-Produktion in dem gentechnisch veränderten E. coli YHP05-Stamm, der mit pHB-CAD und pYHP transformiert wurde. Außerdem wurden E. coli YHP05 und E. coli W3110, das pHB-CAD (ohne pYHP) enthielt, als Kontrollen untersucht. Das Wachstum der Zellen war ähnlich (Abb. 6a), und die drei Zimtaldehyd-Biosyntheseenzyme wurden in allen untersuchten Zellen gut exprimiert (Additional file 6: Abbildung S6). Nach einer 48-stündigen Kultivierung im Kolben wurden die Kulturüberstände gesammelt und die Produktionstiter von Zimtaldehyd mittels HPLC bestimmt. E. coli W3110 (pHB-CAD) und E. coli YHP05 (pHB-CAD) wiesen Cinnamaldehyd-Produktionstiter von 2,18 bzw. 6,3 mg/L auf (Abb. 6b). Im Gegensatz dazu wies E. coli YHP05 (pHB-CAD und pYHP) einen deutlich höheren Produktionstiter (75 mg/L) auf, der 35-mal höher war als der von E. coli W3110 (pHB-CAD).

Nematizide Aktivität von Zimtaldehyd, das von gentechnisch verändertem E. coli produziert wird

Um die nematizide Aktivität von Zimtaldehyd, das im Kulturmedium produziert wird, zu bewerten, wurden Nematoden, B. xylophilus, mit Zimtaldehyd gemäß den in „Methoden“ beschriebenen Verfahren behandelt. Der Kulturüberstand von E. coli YHP05, das pYHP und pHB-CAD enthält, wurde verdünnt, bis die Endkonzentration von Zimtaldehyd 60 mg/L betrug, und die Nematoden wurden mit dem verdünnten Kulturüberstand behandelt. Nach 1 und 4 Stunden überlebten nur 26 % bzw. weniger als 18 % der Nematoden (Abb. 7). Als Positivkontrolle wurden die Nematoden mit handelsüblichem und gereinigtem Zimtaldehyd in einer entsprechenden Konzentration (60 mg/L) behandelt. Nach 4 Stunden waren fast alle Nematoden (95 %) abgetötet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die nematiziden Wirkungen von handelsüblichem Zimtaldehyd und dem in dieser Studie hergestellten Zimtaldehyd ähnlich waren. Als Negativkontrolle wurde auch der Kulturüberstand von E. coli W3110 getestet, und wie erwartet überlebten fast alle Nematoden (>92 %) nach 4 h.