Stein trascorse la sua infanzia a Vienna e a Passy, in Francia, e la sua infanzia a Oakland, in California. Entrò nella Society for the Collegiate Instruction of Women (rinominata Radcliffe College nel 1894), dove studiò psicologia con il filosofo William James e si laureò nel 1898. Studiò alla Johns Hopkins Medical School dal 1897 al 1902 e poi, con suo fratello maggiore Leo, si trasferì prima a Londra e poi a Parigi, dove poté vivere con mezzi privati. Visse con Leo, che divenne un affermato critico d’arte, fino al 1909; in seguito visse con la compagna di una vita, Alice B. Toklas (1877-1967).
Stein e suo fratello furono tra i primi collezionisti di opere dei cubisti e di altri pittori sperimentali del periodo, come Pablo Picasso (che dipinse il suo ritratto), Henri Matisse e Georges Braque, molti dei quali diventarono suoi amici. Al suo salone si mescolavano con scrittori americani espatriati che lei soprannominò la “Generazione Perduta”, tra cui Sherwood Anderson ed Ernest Hemingway, e altri visitatori attirati dalla sua reputazione letteraria. I suoi giudizi letterari e artistici erano venerati, e le sue osservazioni casuali potevano fare o distruggere reputazioni.
Nel suo lavoro, cercò di mettere in parallelo le teorie del cubismo, in particolare nella sua concentrazione sull’illuminazione del momento presente (per il quale spesso si basava sul presente perfetto) e il suo uso di ripetizioni leggermente variate e di estrema semplificazione e frammentazione. La migliore spiegazione della sua teoria della scrittura si trova nel saggio Composition as Explanation (Composizione come spiegazione), che si basa sulle lezioni che tenne alle Università di Oxford e Cambridge e che fu pubblicato come libro nel 1926. Tra le sue opere più profondamente influenzate dal cubismo c’è Tender Buttons (1914), che porta all’estremo la frammentazione e l’astrazione.
Il suo primo libro pubblicato, Three Lives (1909), le storie di tre donne della classe operaia, è stato definito un capolavoro minore. The Making of Americans, una lunga composizione scritta nel 1906-11 ma non pubblicata fino al 1925, era troppo contorta e oscura per il grande pubblico, per il quale rimase essenzialmente l’autrice di versi come “La rosa è una rosa è una rosa è una rosa”. Il suo unico libro che raggiunse un vasto pubblico fu The Autobiography of Alice B. Toklas (1933), in realtà l’autobiografia della stessa Stein. La rappresentazione negli Stati Uniti del suo Four Saints in Three Acts (1934), che il compositore Virgil Thomson aveva trasformato in un’opera, portò ad un trionfale tour di conferenze americane nel 1934-35. Thomson scrisse anche la musica per la sua seconda opera, The Mother of Us All (pubblicata nel 1947), basata sulla vita della femminista Susan B. Anthony. Uno dei primi racconti della Stein, “Q.E.D.”, fu pubblicato per la prima volta in Things as They Are (1950).
L’eccentrica Stein non era modesta nella sua autovalutazione: “Einstein è stato la mente filosofica creativa del secolo, e io sono stata la mente letteraria creativa del secolo”. Divenne una leggenda a Parigi, specialmente dopo essere sopravvissuta all’occupazione tedesca della Francia e aver fatto amicizia con i molti giovani militari americani che la visitavano. Scrisse di questi soldati in Brewsie e Willie (1946).