5 Regulation of Intracellular Anion Concentrations
La regolazione del cloruro dipende dal coordinamento di diversi processi (Fig. 2). Alcuni canali di fuga del cloruro sono stati suggeriti per ridurre la concentrazione intracellulare di cloruro agendo come valvole a senso unico. Questa idea deriva dall’osservazione che i canali del cloruro come il ClC-2 (gene clcn2) sono più permeabili al cloruro che esce dalla cellula che al cloruro che entra nella cellula.35 Indipendentemente da questa permeabilità differenziale, che viene chiamata rettificazione, la direzione del flusso di cloruro dipende ancora dalla forza motrice del cloruro. Ciò significa che il cloruro raramente o mai avrà l’opportunità di uscire dalla cellula attraverso il ClC-2 perché la forza motrice del cloruro è quasi sempre nella direzione opposta. Poiché la “valvola” è imperfetta, i canali ClC-2 lasciano effettivamente trapelare il cloruro nella cellula.36
Il fallimento dei canali nel far uscire il cloruro dalla cellula evidenzia la necessità di diversi meccanismi di trasporto ionico che possano muovere il cloruro contro il suo gradiente.37 I cotrasportatori, o simportori, muovono due o più specie ioniche nella stessa direzione attraverso la membrana cellulare; il cloruro può muoversi contro il suo gradiente, appoggiandosi ad un altro ione che si muove lungo il suo gradiente. Gli scambiatori, o antiporters, fanno effettivamente la stessa cosa ma accoppiando il movimento di specie ioniche che scorrono in direzioni opposte attraverso la membrana. Il principale estrusore di cloruro nei neuroni è il cotrasportatore potassio-cloruro 2 (KCC2) (gene slc12a5). KCC2 permette agli ioni di cloruro di fare da cavalluccio agli ioni di potassio che scorrono lungo il loro gradiente e fuori dalla cellula. Il processo è elettroneutrale a causa della stechiometria 1:1 di cloruro e potassio. Il processo non è attivo in quanto non coinvolge direttamente l’idrolisi dell’ATP (e quindi non dovrebbe essere indicato come pompaggio); invece, il processo è secondariamente attivo poiché KCC2 si basa sul gradiente di potassio che è mantenuto dalla sodio-potassio ATPasi, che pompa potassio nella cellula.
Il sodio-potassio-cloruro-cotrasportatore 1 o NKCC1 (gene slc12a2) è un altro importante contributore all’omeostasi neuronale del cloruro. NKCC1 sfrutta il gradiente di sodio per spostare il potassio e il cloruro nella cellula, determinando così un’alta concentrazione intracellulare di cloruro. Questo è ovviamente l’opposto di come KCC2 influenza il cloruro. L’espressione relativa di NKCC1 e KCC2 detta quindi la concentrazione intracellulare di cloruro, nonostante gli effetti del carico di cloruro attraverso vari canali del cloruro, compresi i canali GABAA e glicina attivati. Diversi punti dovrebbero essere notati. In primo luogo, NKCC1 è fortemente espresso all’inizio dello sviluppo, mentre KCC2 è solo debolmente espresso, ma un interruttore di sviluppo si verifica che porta al modello inverso in età adulta.38,39 Nel corno dorsale spinale del ratto, Eanion sembra raggiungere il suo valore maturo circa 2 settimane dopo la nascita,40 ma piena capacità di estrusione del cloruro non è raggiunto fino a 3-4 settimane dopo la nascita41; in altre parole, carichi di cloruro più facilmente sopraffare KCC2-mediata estrusione di cloruro nei neuroni giovani. In secondo luogo, l’interruttore di sviluppo non si verifica nei neuroni afferenti primari, il che significa che i livelli di NKCC1 rimangono elevati, con conseguenti alte concentrazioni intracellulari di cloruro in queste cellule.42,43 In terzo luogo, NKCC1 e KCC2 non sono espressi uniformemente anche all’interno di un singolo neurone, il che può portare a un’alta concentrazione di cloruro intracellulare in un compartimento (come il segmento iniziale dell’assone) e una bassa concentrazione di cloruro intracellulare in altri compartimenti (come il soma e i dendriti).44,45 E infine, i normali livelli adulti di espressione di KCC2 possono essere patologicamente alterati (Sezione 8).
Qualche cenno deve essere fatto su come vengono condotte le registrazioni elettrofisiologiche poiché questo può (deliberatamente o inavvertitamente) portare a cambiamenti nella concentrazione intracellulare di cloruro. Con la tecnica del patch clamp su tutta la cellula, la membrana cellulare viene rotta per ottenere l’accesso elettrico alla cellula dopo aver sigillato la pipetta alla membrana cellulare; di conseguenza, il citosol viene dializzato con la soluzione della pipetta. La soluzione della pipetta è spesso progettato per avere una concentrazione di cloruro approssimando il livello intracellulare naturale, ma a volte ha deliberatamente una concentrazione elevata di cloruro al fine di aumentare la forza motrice cloruro (ad esempio, per facilitare il rilevamento di piccole correnti postsinaptiche inibitorie). Entrambi gli approcci sono accettabili a seconda della domanda che viene posta. Ma, in entrambi i casi, dializzando la cella significa che il cloruro intracellulare è effettivamente bloccato a o vicino al livello di cloruro nella soluzione pipetta, che non è ovviamente appropriato per misurare il livello di cloruro naturale nella cella. Questo problema può essere risolto utilizzando la tecnica del patch perforato.46 Detto questo, la dializzazione della cellula può essere utilizzato per testare la capacità di estrusione, determinando se la concentrazione di cloruro intracellulare si equilibra con la concentrazione della pipetta o se la cellula riesce a mantenere un livello inferiore a causa dei suoi meccanismi di estrusione.47,48 Inoltre, in tensione morsetto, potenziale di membrana è bruscamente cambiato e tenuto a valori scelti arbitrariamente, che può portare a forze di guida molto innaturale cloruro. Come spiegato da Ratté e Prescott,36 tali dettagli sperimentali devono essere attentamente considerati per evitare interpretazioni errate.
Come già detto, bicarbonato scorre fuori attraverso attivato GABAA e recettori della glicina. La probabilità che l’efflusso di bicarbonato causi un accumulo extracellulare è bassa, data la diffusione relativamente libera del bicarbonato nello spazio extracellulare, ma l’efflusso di bicarbonato può esaurire i livelli intracellulari di bicarbonato e causare un calo del pH.49 Tuttavia, questo tende a non verificarsi in condizioni normali perché il bicarbonato intracellulare viene reintegrato dalla conversione di anidride carbonica e acqua in bicarbonato e protoni da parte dell’enzima anidrasi carbonica; come gas, l’anidride carbonica si diffonde liberamente attraverso la membrana cellulare. Il bicarbonato intracellulare può essere impoverito (e quindi il suo efflusso limitato) attraverso il blocco dell’anidrasi carbonica da parte dell’acetazolamide,32 che può infatti avere effetti analgesici (Sezione 9). La regolazione del pH implica altre reazioni chimiche e meccanismi di trasporto, e lo stesso bicarbonato può essere trasportato attraverso la membrana cellulare in cambio di cloruro.50
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