FFPE vs tessuto congelato sarà esplorato in questo articolo. La ricerca medica sul cancro e altre malattie richiede l’accesso a strumenti e materiali unici – compresi i campioni da studiare. Per esempio, se si sta esaminando la forma e la struttura delle cellule (morfologia), gli stati di malattia, la comunicazione intra- e intercellulare, o argomenti correlati, è incredibilmente utile avere accesso a sezioni affidabili di tessuto biopsied. Poiché la maggior parte dei materiali biologici sono fragili e deperibili, bisogna fare attenzione a prepararli e conservarli correttamente. Ci sono due principali metodi di preparazione dei tessuti utilizzati oggi. Per decenni, i tessuti sono stati saturati con formalina (alias formaldeide) e poi inseriti in un blocco di cera di paraffina (indicato come tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina o FFPE). Con l’avvento di affidabili congelatori a bassissima temperatura e abbondanti forniture di azoto liquido, è diventato possibile congelare i tessuti come secondo mezzo di conservazione a lungo termine. Ciascuno di questi due metodi presenta vantaggi e svantaggi. Quello che segue è un confronto dei punti di forza e di debolezza di questi due metodi di conservazione.
TessutiFFPE
I tessuti fissati in paraffina fissati in normalina sono le fonti più comuni di materiale archiviato. I patologi ospedalieri hanno creato e archiviato tessuti FFPE per decenni. Ogni volta che studiano una biopsia presa da un paziente, archiviano parte di questo materiale per un uso successivo – a volte facendo riferimento ad esso, o ottenendo una seconda opinione, durante il corso del trattamento di un paziente. I ricercatori hanno anche conservato tessuti donati da esseri umani, o materiali raccolti da animali, per creare archivi di materiali per studi successivi. Questi archivi sono chiamati “biobanche” e possono essere sviluppati da università e ospedali, o creati per scopi commerciali da aziende che servono la comunità di ricerca. Queste attività hanno portato alla disponibilità di vaste collezioni di materiale per studi successivi. Poiché questi archivi sono stati creati in un arco di tempo molto lungo, possono offrire una prospettiva storica, oltre ad essere semplicemente una fonte abbondante di materiale di ricerca. Poiché il tessuto FFPE può essere conservato in un armadio a temperatura ambiente, è economico creare una grande collezione che sarà stabile per un tempo molto lungo. La formalina e la cera preservano le strutture fragili all’interno e tra le cellule del tessuto – il che rende il tessuto FFPE ottimo per chi osserva la morfologia delle cellule e dei tessuti – come i patologi che studiano le biopsie conservate per diagnosticare il cancro. Anche le proteine nel tessuto FFPE sono conservate, non solo le strutture visibili al microscopio. Gli istologi possono usare anticorpi marcati con la fluorescenza (o anticorpi marcati con altri mezzi) che si legano specificamente a certe proteine per vedere se sono presenti in certe cellule nei tessuti, e se le posizioni e le quantità di queste proteine sono diverse nei tessuti malati e in quelli sani. Questo metodo è chiamato immunoistochimica (IHC). Infine, poiché l’FFPE è un metodo antico e consolidato per la conservazione dei tessuti, i patologi sono abituati a esaminare e a fare diagnosi con le biopsie di tessuto FFPE. Se vuoi saperne di più leggi il nostro post sul blog, cos’è il tessuto FFPE e quali sono i suoi usi.
Svantaggi del tessuto FFPE
La normalina è volatile, tossica e ha un odore orribile. La maggior parte delle procedure di incapsulamento e di fissazione della paraffina sono anche laboriose e richiedono molto tempo. Inoltre, mentre le proteine sono conservate, sono anche denaturate. Non sono più biologicamente attive. Inoltre, potrebbero non legarsi agli stessi anticorpi delle versioni non denaturate (o native) delle stesse proteine. Questo può in qualche modo limitare il loro valore per certi tipi di studi IHC, e renderli inutili per l’analisi biochimica. Un altro problema è che gli acidi nucleici (DNA e RNA) nei tessuti FFPE non sono conservati molto bene. Anche se gli acidi nucleici possono essere isolati da questo tipo di tessuto conservato, l’uso può essere limitato. Pertanto, il tessuto FFPE può non essere sempre adatto all’analisi genetica molecolare. Infine, la maggior parte dei protocolli FFPE non sono standardizzati. Questo significa che non c’è garanzia che i campioni raccolti in tempi o luoghi diversi siano stati preparati in modo simile. I metodi di preparazione non standardizzati possono influenzare in modo sproporzionato i risultati ottenuti – specialmente nel caso dell’analisi genetica molecolare. Alcune analisi molecolari possono essere fatte, ma molto viene perso quando il tessuto viene conservato usando il metodo FFPE.
Tessuti congelati
I tessuti congelati, d’altra parte, funzionano molto bene per l’analisi genetica molecolare – specialmente se i materiali bioptici sono immersi in azoto liquido in un metodo chiamato “flash freezing”, e poi conservati in un congelatore ultra freddo a meno di -80 gradi Celsius. Quindi, se si dispone di un congelatore “-80” e di azoto liquido, i tessuti freschi congelati sono facili da preparare. I campioni di array di tessuti congelati sono anche molto utili per l’analisi IHC, poiché le proteine sono conservate in uno stato nativo. Queste proteine “native” non denaturate possono anche essere isolate in una forma ancora attiva, per l’analisi biochimica. Il tessuto si degrada rapidamente a temperatura ambiente, tuttavia, e non si conserva bene se conservato in un più standard “-20” cibo o congelatore domestico. Bisogna congelarlo il prima possibile, e poi tenerlo molto freddo. Per il tessuto bioptico, questo può essere difficile, poiché i chirurghi non possono avere a portata di mano l’azoto liquido per congelare il materiale tumorale estratto. È necessario anche un congelatore dedicato a bassissima temperatura per mantenere il tessuto congelato in ogni momento. Gli archivi di tessuti congelati sono sempre vulnerabili alle interruzioni di corrente o ai guasti meccanici. I tecnici senza auto possono anche lasciare campioni preziosi sui loro banchi di laboratorio, o dimenticare di chiudere la porta di un congelatore. Infine, essendo un metodo più recente, le biobanche hanno generalmente collezioni più piccole di tessuti congelati.
Sommario del tessuto FFPE VS congelato
In sintesi, i tessuti FFPE sono adatti a creare grandi archivi di tessuti per la ricerca. Una volta preparato, il tessuto FFPE è molto resistente. Non ha bisogno di attrezzature speciali per mantenerlo stabile per decenni. I patologi hanno fatto diagnosi dal tessuto FFPE per decenni e lo conoscono molto bene. Il tessuto FFPE può essere utilizzato anche per alcuni studi IHC. Il tessuto FFPE può non essere adatto per l’analisi delle proteine native, e generalmente è inferiore per i tipi di analisi genetica, come PCR, qPCR, o sequenziamento del DNA di prossima generazione, che stanno diventando comuni. Il tessuto congelato, invece, conserva il DNA, l’RNA e le proteine native. Tuttavia, gli archivi dei tessuti congelati possono essere rapidamente persi a causa di interruzioni di corrente, guasti meccanici o disattenzione in laboratorio. I tessuti congelati sono anche meno familiari ai patologi, che sono generalmente più a loro agio nel fare diagnosi dopo l’analisi microscopica del tessuto FFPE.