Integrierte Synthese von Nukleotid- und Nukleosidstrukturen unter dem Einfluss von Aminosäuren

Gleichzeitige Bildung von Glykosylierungsprodukten

Die Bildung von Nukleosid- und Nukleotidstrukturen aus einfachen Vorläufern wurde gleichzeitig mit drei Nukleobasen durch Dehydratisierungsreaktionen erreicht. Dies steht im Gegensatz zu früheren Arbeiten auf diesem Gebiet, bei denen die Bedingungen optimiert wurden, um bestimmte Produkte zu begünstigen24,25,26. In einem typischen Glykosylierungsexperiment wurden Adenin und P-Ribose 5 Stunden lang bei 90 °C und pH 2,5 erhitzt. Bei der Kombination von Adenin und P-Ribose beobachteten wir die Bildung von Adeninmonophosphat (AMP)-Nukleotid (und dessen Isomeren). Die extrahierten Ionenchromatogramme (EICs) aus der HPLC-MS-Analyse der Produkte zeigten mehrere Peaks mit m/z-Übereinstimmung + und + (ergänzende Abbildungen 13-15). Der Vergleich mit Standards bestätigte, dass das AMP dem bei RT = 4,2 min gefundenen Peak entspricht (ergänzende Abb. 5, 6); andere Hauptpeaks könnten mit AMP-Isomeren, wie dem N6-ribosylierten Isomer, übereinstimmen. Um dies zu bestätigen, wurde eine Hydrolysereaktion in Gegenwart von NaOH (0,1 M) durchgeführt, um zu versuchen, zwischen den verschiedenen Isomeren zu unterscheiden, da das N6-ribosylierte Isomer anfälliger für Hydrolyse ist. Es ist jedoch eine leichte Störung der Peaks zu beobachten, was es schwierig macht, die Identität des N6-ribosylierten Isomers zu bestätigen. Anschließend analysierten wir zwei reine Standards von zwei verschiedenen Isomeren (Adenosin-3′-Monophosphat und Adenosin-5′-Monophosphat-Monohydrat) einzeln und in einem Gemisch, um das Elutionsprofil der Isomere aufzuklären (ergänzende Abbildungen 148, 149). Bei der Standardmischung ist eine Verschiebung der Retentionszeit zu beobachten, die eine bessere Korrelation mit der Elution dieser Verbindungen in der realen Probe ermöglicht. Obwohl es schwierig ist, zwischen den Isomeren zu unterscheiden, können wir das Vorhandensein von mindestens zwei Isomeren innerhalb der AMP-Produkte bestätigen, indem wir das Elutionsprofil der Standardmischung mit der realen Probe vergleichen. Es ist nun klar, dass die Bildung verschiedener Isomere (ergänzende Abb. 12) ein möglicher Grund für die Elution von Nukleotiden mit denselben Massen zu unterschiedlichen Retentionszeiten ist. Darüber hinaus zeigt die MS/MS-Analyse unserer Reaktionsprodukte eine Fragmentierung von AMP (und seinen Isomeren) zu Adenin (m/z = 136,0617 ± 0,01) (ergänzende Abb. 20); dies stimmt mit der Fragmentierung des kanonischen AMP-Standards überein. Der von uns vorgeschlagene Reaktionsmechanismus besteht in der Bildung einer glykosidischen Bindung zwischen einer 1′-OH-Gruppe der Ribose und einer Aminogruppe des Adenins (siehe ergänzende Abb. 12).

Die Zeitverlaufsreaktionen zeigen, dass die Wasserverdampfung die Hauptantriebskraft für die Bildung von Glykosylierungsprodukten ist, wobei ein signifikanter Anstieg der Bildung von Nukleosid- und Nukleotidstrukturen im Zeitraum zwischen 2 und 4 h zu verzeichnen ist (Abb. 2a). Dies entspricht dem Zeitbereich, in dem das Probenvolumen drastisch verringert wird und die Reagenzien extrem konzentriert sind. Nach 5-6 h Reaktionszeit erreicht die Probe Trockenheit und die Reaktionsgeschwindigkeit (gefolgt von der Intensität bei HPLC-MS-Messungen) stabilisiert sich. Zusätzlich zu AMP wurden glykosidische Bindungen enthaltende Produkte, einschließlich zyklischer Nukleotide (z. B. cAMP)27 und Nukleoside (z. B. Adenosin), mittels RP-HPLC-MS und MS/MS nachgewiesen und auf die Bildung von 1,N6-Etheno-Derivaten28,29 getestet, was durch Vergleich mit Standards bestätigt wurde (Abb. 2, ergänzende Abb. 7-11, ergänzende Abb. 23-27). Die Retentionszeiten der kanonischen Standards 2′,3′-cAMP und 3′,5′-cAMP stimmten nicht mit den Retentionszeiten der EIC-Peaks in der Probe überein. Die Massenverteilungen (+; +) und Fragmentierungsmuster (+) waren jedoch identisch (ergänzende Abb. 16-21). Diese Ergebnisse zeigen, dass zwar zyklische Strukturen gebildet werden, das kanonische cAMP aber nicht das Hauptprodukt ist. Der Vergleich mit einem analytischen Adenosin-Standard zeigt auch, dass Adenosin zusammen mit einer Reihe von isomeren Spezies bei der Kondensationsreaktion von P-Ribose und Adenin gebildet wird (ergänzende Abbildungen 18-22). Während die kanonischen Formen von AMP und Adenosin in diesen Experimenten bestätigt wurden, waren sie nicht die Hauptprodukte in der Dehydratisierungsreaktion.

Wenn Phosphat separat als Pyrophosphat zugeführt wurde und mit Adenin und Ribose reagierte, wurde eine Verbindung mit der Masse von Adenosin und eine geringe Menge von AMP und cAMP nachgewiesen, und Adenosin bildete sich auch dann, wenn keine Phosphatquelle vorhanden war (ergänzende Abbildungen 33-41). Es ist erwähnenswert, dass wir uns bei unseren Studien absichtlich auf die Identifizierung phosphorylierter Produkte (AMP-Isomere und cAMP-Isomere) konzentriert und der Identifizierung phosphorylierter Produkte, die keine AMP-Isomere und cAMP-Isomere sind, weniger Aufmerksamkeit geschenkt haben30,31,32. Wir schlagen die Bildung einer glykosidischen Bindung zwischen der Hydroxylgruppe der Ribose und einer Aminogruppe des Adenins vor, die durch den Verlust eines Wassermoleküls durch Verdampfung ausgelöst wird. Die relative Reaktivität der primären und sekundären Aminogruppen in Adenin ist gut untersucht33 , und ohne Aktivierung oder das Vorhandensein einer Schutzgruppe wird die glykosidische Bindung am primären Amin normalerweise bevorzugt. Daher ist nicht zu erwarten, dass das kanonische Isomer von Adenosin/AMP ein Hauptprodukt ist, da es ausschließlich eine Reaktion am sekundären Amin erfordern würde. Allerdings ist die Reaktivität an der sekundären Aminstelle ausreichend hoch, so dass die kanonischen Isomere gebildet werden können, wenn auch nicht als Hauptprodukt. Bei anderen Nukleobasen, wie z. B. Guanin, gibt es noch mehr zugängliche Amingruppen, und das Potenzial für isomere Produkte ist größer. Die Reaktivität von Ribose erfolgt wahrscheinlich hauptsächlich über die anomere Position, was zu weniger möglichen Isomeren führt, obwohl einige andere kleinere Produkte beobachtet werden können.

Die Reaktivität anderer kanonischer Nukleobasen (Cytosin, Guanin und Thymin) mit P-Ribose wurde ebenfalls untersucht. Nach der Dehydratisierungsreaktion von Guanin und Cytosin mit P-Ribose wurden Massen nachgewiesen, die den Nukleosid- und Nukleotidstrukturen entsprechen (Abb. 3 und ergänzende Abbildungen 50-64). Guanin-Glykosylierungsstrukturen wurden in relativ geringem Umfang gebildet, was wahrscheinlich auf die begrenzte Löslichkeit von Guanin bei niedrigem pH-Wert zurückzuführen ist. Die für 5-Methyluridinmonophosphat (m5UMP) und 5-Methyluridin (Thymin-Nukleosid) gemessenen Produktmengen waren sogar geringer als ihre Äquivalente aus Guanin und Cytosin (Abb. 3 und ergänzende Abb. 65, 66). Diese Ergebnisse lassen sich durch das Vorhandensein einer primären Aminogruppe in Guanin und Cytosin erklären, die in Thymin fehlt. Alle drei Nukleobasen haben zwar sekundäre Aminogruppen, doch sind diese bei der Bildung glykosidischer Bindungen weniger reaktiv. Daher wird die Bildung von Nukleosid- und Nukleotidstrukturen durch eine sekundäre Aminreaktion, wie sie für die Bildung kanonischer Glykosylierungsprodukte erforderlich ist, bei Nukleobasen, bei denen primäre Amine vorhanden sind, benachteiligt. Dies hat eine interessante Auswirkung auf die Annahme der Nukleinsäurechemie bei der Entstehung des Lebens, da es darauf hindeutet, dass die kanonischen Nukleotide zunächst ungeeignet waren, bis weitere biochemische Mechanismen entstanden, die die Selektivität für die richtigen Isomere erhöhten. Daher wurden in unseren Experimenten erwartungsgemäß zwar kanonische Nukleotid- und Nukleosidprodukte von Cytosin und Guanin gebildet, sie entsprachen jedoch nicht den beobachteten Hauptpeaks (siehe ergänzende Abbildungen 42-49). Aus der Kombination dieser beiden Beobachtungen (unterschiedliche Retentionszeiten, aber gleiche Massenverteilung wie bei den kanonischen Standards in den EICs) können wir schließen, dass es sich bei den aus der Dehydratisierungsreaktion von Guanin/Cytosin mit P-Ribose gebildeten Nucleotid- und Nucleosid-Spezies hauptsächlich um isomere Spezies der kanonischen Nucleotide und Nucleoside handelt (einige mögliche Strukturen sind in den ergänzenden Abbildungen 50 und 51 dargestellt). 50, 51).

Typischerweise wurde die Bildung von Nukleotidstrukturen unter spezifischen Bedingungen in Abhängigkeit von der verwendeten Nukleobase durchgeführt, um ein bestimmtes Reaktionsprodukt zu erhalten. In einem alternativen Ansatz haben wir beschlossen, mehrere Nukleobasen gleichzeitig in die Reaktion mit P-Ribose einzubeziehen. Unser Ziel war es, festzustellen, ob die Produktbildung mit mehreren Nukleobasen unter denselben Reaktionsbedingungen ein Gemisch von Produkten ergibt oder von einem dominiert wird. Diese Reaktion wurde durchgeführt, indem zwei oder drei Nukleobasen (Adenin, Guanin und Cytosin) gleichzeitig mit P-Ribose in das Reaktionsgefäß gegeben wurden. Es wurde eine Mischung von Glykosylierungsprodukten erhalten, die sowohl Nukleotide (AMP, GMP und CMP) als auch die entsprechenden zyklischen Nukleotid- (cAMP, cGMP und cCMP) und Nukleosidprodukte (Adenosin, Guanosin und Cytidin) umfasste (ergänzende Abbildungen 67-95). Guanin-Glykosylierungsprodukte wurden in geringerer Ausbeute gebildet als die von Adenin und Cytosin, wie aufgrund der geringen Löslichkeit von Guanin unter sauren Bedingungen zu erwarten war.

Nukleobasenaustausch

Nukleobasenaustausch wurde beobachtet, als Na+AMP 5 h lang bei 90 °C in sauren wässrigen Medien mit Cytosin oder Guanin erhitzt wurde. Der Nukleobasenaustausch führte zur Bildung von Nukleotid- (CMP oder GMP), zyklischen Nukleotid- (cCMP oder cGMP) und Nukleosidstrukturen (Cytidin oder Guanosin) (siehe ergänzende Abbildungen 96-102 und ergänzende Tabelle 1 für halbquantitative Ergebnisse). In diesem Experiment zeigten CMP und Cytidin eine steigende Tendenz in der Intensität, während cCMP bei 12,5 mM eine maximale Intensität erreichte und dann bis zu einer Intensität von 4,0 × 104 AU abfiel (ergänzende Abb. 102a und 155-158). Bei einer Cytosin-Konzentration von 37,5 mM war CMP die Verbindung mit der höheren Intensität, und die für cCMP und Cytidin gemessenen Intensitäten waren fast identisch. In den EICs von CMP und cCMP wurden zwei isomere Hauptarten beobachtet. Im Falle von CMP wurden +, + und + Massen festgestellt, während cCMP +, + und + innerhalb ihrer jeweiligen Massenverteilungen zeigte. Im Falle von Cytidin war + der wichtigste nachgewiesene Peak. Diese Massenverteilungen stimmten mit den in den Standards beobachteten überein. Die Retentionszeit der Hauptisomere stimmte jedoch nicht mit der des kanonischen CMP und Cytidin überein. Als AMP mit steigenden Konzentrationen von Guanin umgesetzt wurde (ergänzende Abb. 102b), erreichten alle drei Glykosylierungsprodukte (GMP, cGMP und Guanosin) einen Maximalwert, wenn die Guaninkonzentration 2,5 mM betrug (ergänzende Abb. 160-162). Diese Ergebnisse waren die Folge der begrenzten Löslichkeit von Guanin bei saurem pH-Wert, so dass die effektive Konzentration in der Lösung gleich blieb, auch wenn mehr Guanin in das Reaktionsgefäß gegeben wurde. Nach dem Höchstwert blieb die Intensität von cGMP und Guanosin konstant, was auf die geringe Löslichkeit von Guanin zurückzuführen ist. Nur ein geringer Anstieg der Intensität aller drei Guanin-Glykosylierungsprodukte wurde beobachtet, wenn = 37,5 mM, was mit einer größeren Präsenz von Guanin in der Lösung aufgrund der hohen zugesetzten Konzentration zusammenhängen könnte. Im EIC von GMP wurde ein breiter Bereich ohne klar definierte Peaks beobachtet, obwohl zwei Hauptpeaks hervorstachen. + war die einzige chemische Spezies, die mit Guaninverbindungen verwandt war und in der Massenverteilung im EIC nachgewiesen wurde. Bei der Extraktion des EIC von cGMP aus den MS-Daten wurden vier paarweise gruppierte Peaks beobachtet, und die Massenverteilung zeigte + und + Spezies. Andererseits wies die EIC von Guanosin drei Peaks auf, von denen der intensivste das Vorhandensein von + in seiner Massenverteilung zeigte.

Die Bildung von Cytosin- und Guanin-Glykosylierungsprodukten zeigte, dass die Spaltung der glykosidischen Bindung von AMP unter unseren Reaktionsbedingungen stattfand. Bei der Analyse der EICs von AMP, cAMP und Adenosin wurden in jedem Chromatogramm mehrere Peaks beobachtet, was die Theorie unterstützt, dass die glykosidischen Bindungen während der Dehydratisierungsreaktion dynamisch hydrolysiert/gebildet werden34. Die Reaktionen von Cytosin- und Guanin-Nukleotiden mit Adenin wurden ebenfalls untersucht. Bei der Dehydratisierungsreaktion von CMP und Adenin konnten keine Produkte beobachtet werden, die einem Nukleobasenaustausch entsprechen (ergänzende Abb. 103-108/a). Bei der Reaktion von GMP mit Adenin wurden jedoch eindeutig Adenin-Glykosylierungsprodukte nachgewiesen (ergänzende Abb. 105-108/b). Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Hydrolyse der glykosidischen Bindungen in GMP unter den gleichen Reaktionsbedingungen einfacher ist als bei CMP34. Wir haben auch die Nukleobasen-Austauschreaktion mit UMP und Adenin durchgeführt, um sie mit dem direkten Pyrimidin-Analogon von Adenin zu vergleichen (ergänzende Abb. 109). Die Ergebnisse ähnelten eher den in der ergänzenden Abb. 108 gezeigten CMP-Ausbeuten als den GMP-Ausbeuten, wobei eine sehr geringe Ausbeute für die Adenin-Glykosylierungsprodukte in der UMP-Reaktion erzielt wurde, die für den Nachweis von AMP und cAMP nicht ausreicht.

Aminosäuren wirken sich auf die Verteilung der Glykosylierungsprodukte aus

Wie bereits erwähnt, könnten Aminosäuren, Nukleotide und ihre Bausteine auf der frühen Erde gleichzeitig vorhanden gewesen sein. Daher könnten Produkte einer Copolymerisationsreaktion oder sogar Produkte, die aus einem katalytischen Effekt einer Polymerart gegenüber der anderen resultieren, in einer präbiotischen Umgebung entstanden sein. Um die Co-Reaktivität von Nukleotidbausteinen und Aminosäuren in einer Eintopf-Dehydratisierung zu untersuchen, wurde Glycin, die einfachste Aminosäure, in die Dehydratisierungsreaktionen von P-Ribose und entsprechenden Nukleobasen einbezogen. Der Einbau von Glycin hatte eine deutliche Auswirkung auf die Bildung von Glykosylierungsprodukten und führte zu einer Verringerung der Gesamtausbeute an Produkten mit der Masse von AMP-Isomeren, cAMP-Isomeren und Adenosin (Abb. 4a und ergänzende Abb. 28-32). Dies deutet darauf hin, dass Glycin eine Rolle spielt, indem es entweder Nukleotidbausteine (P-Ribose und/oder Adenin) durch eine Nebenreaktion verbraucht oder sich an die Produktstruktur anlagert und deren Masse verändert. Die EIC-Analyse für diese Reaktionen zeigt Peaks, die der Masse der Glycin-Addukte entsprechen (d. h. AMP-Gly, cAMP-Gly, Adenosin-Gly und Adenin-Gly) (ergänzende Abbildungen 115-122), obwohl diese Nebenprodukte nicht in ausreichender Menge gebildet werden, um alle beobachteten Veränderungen zu erklären. Glycin-Addukte wurden auch bestätigt, indem deuteriertes Glycin als Ausgangsmaterial zusammen mit P-Ribose und Adenin verwendet wurde, was zu Veränderungen in der Isotopenverteilung der Adduktmassen führte (ergänzende Abb. 123, 124). Eine maximale semi-quantitative Ausbeute von 59 % wurde für die Bildung von Glykosylierungsprodukten (AMP-Isomere, zyklische AMP-Isomere und Adenosin) bei der Reaktion von P-Ribose und Adenin erzielt; allerdings wurde nur eine Ausbeute von 46 % erreicht, wenn Glycin ebenfalls im Reaktionsmedium vorhanden war (ergänzende Abb. 144). Die Quantifizierung der Ausbeuten für alle möglichen einzelnen Isomere ist technisch schwierig, aber die halbquantitativen Ausbeuten einiger Isomere konnten mit reinen Standards bestimmt werden: Adenosin-5′-Monophosphat und Adenosin-2′,3′-cyclisches Monophosphat wurden in Abwesenheit von Glycin mit 38,7 % bzw. 18,2 % gefunden, während die Ausbeute in Anwesenheit von Glycin für beide Isomere signifikant gesenkt wurde (<2 %).

Glycin beeinflusste auch die Verteilung der isomeren Spezies, und es wurden deutliche Unterschiede im Vergleich zum Base-Peak-Chromatogramm (BPC) aus der Reaktion von P-Ribose und Adenin in Anwesenheit und Abwesenheit von Glycin beobachtet (Abb. 4b und ergänzende Abb. 110-114). Diese Daten wiesen auf das Vorhandensein unterschiedlicher chemischer Spezies und eine daraus resultierende Änderung der Massenverteilung zwischen den Reaktionen mit und ohne Glycin hin. Anschließend wurden die einzelnen EICs für jedes Adenin-Glykosylierungsprodukt analysiert, was zu deutlichen Unterschieden in den relativen Peak-Intensitäten führte, wenn Glycin hinzugefügt wurde. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass Glycin eine selektive Wirkung darauf hat, welche isomeren Spezies bevorzugt gebildet werden. Es ist bekannt, dass Glycin unter dehydrierenden Bedingungen leicht mit anderen Aminen reagiert12 , und es ist wahrscheinlich, dass es mit den primären Aminen der Nukleobasen reagiert. Hybride Seitenprodukte, die Glycin enthalten (Gly-AMP, Gly-cAMP, Gly-Adenosin, Gly-Adenin), wurden in einer Ausbeute von ~1 % nachgewiesen (siehe ergänzende Abb. 145), aber dieser geringe Prozentsatz hat eine wichtige Auswirkung auf die isomere Verteilung der Adenin-Glykosylierungsprodukte (siehe ergänzende Abb. 146, 147). Eine Änderung der Isotopenverteilung der Massen der Hybridprodukte wurde festgestellt (ergänzende Abbildungen 123, 124), wenn deuteriertes Glycin in die Dehydratisierungsreaktion einbezogen wurde, was die Einbeziehung von Glycin in die Hybridstrukturen bestätigt.

Ein ähnlicher Effekt auf die Isomerenverteilung wurde auch beobachtet, wenn P-Ribose mit Cytosin/Guanin in Gegenwart von Glycin umgesetzt wurde (Abb. 4c, ergänzende Abbildungen 125-140). Die maximalen Intensitäten der verschiedenen isomeren Spezies nahmen ab (GMP, CMP, cGMP, cCMP, Guanosin und Cytidin), während die Verteilung der relativen Intensitäten ebenfalls beeinflusst wurde. Die Unterschiede zwischen den Experimenten wurden mit Hilfe einer statistischen Methode wie der Clusteranalyse der EIC-Daten genau überprüft, um die Proben in Anwesenheit und Abwesenheit von Glycin in Gruppen/Cluster mit gemeinsamen Merkmalen zu unterteilen (Abb. 5). Ziel der Clusteranalyse in dieser Studie ist es, die Daten (d. h. die Bildung von Nukleotid- und Nukleosidstrukturen) in Gruppen mit gemeinsamen Merkmalen zu gruppieren (z. B. Zugabe von Glycin bzw. kein Glycin). Diese Analyse sollte eine hohe interne Homogenität innerhalb von Clustern/Gruppen und eine hohe externe Heterogenität zwischen Clustern/Gruppen zeigen. Abb. 5 zeigt ein Dendrogramm mit „Wards“-Verknüpfung35. Zur Identifizierung von Clustern im Dendrogramm haben wir die Spektren entsprechend dem Vorhandensein von Glycin eingefärbt (Glycin – rot, kein Glycin – schwarz, leer – blau). Wie zu erkennen ist, sind glycinhaltige Proben in Clustern zusammengefasst. Ein Cluster entspricht P-Ribose + Adenin + Glycin (drei Proben), das von Proben ohne Glycin getrennt ist. Ein zweiter Cluster entspricht P-Ribose + Guanin + Glycin und P-Ribose + Cytosin + Glycin. Proben, die Adenin enthalten, bilden einen größeren Cluster, der sich von den anderen Proben unterscheidet, was auf einen starken Einfluss von Adenin auf die Reaktion hindeutet. In der Tat gibt es eine Reihe anderer möglicher Produkte und Reaktionen, die unter den durchgeführten Reaktionsbedingungen stattfinden könnten (siehe ergänzende Anmerkung 1 und ergänzende Abbildungen 150-162 für weitere Einzelheiten).

Auch andere Aminosäuren wurden in die Dehydratisierungsreaktion von Adenin mit P-Ribose einbezogen, um zu testen, ob sie ebenfalls einen Einfluss auf die isomere Verteilung der Glykosylierungsprodukte haben würden (ergänzende Abbildungen 141-143). Die sechs für diese Studie ausgewählten Aminosäuren (Arginin, Glutaminsäure, Threonin, Methionin, Phenylalanin und Tryptophan) haben unterschiedliche Seitenketten mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften und funktionellen Gruppen. Beim Vergleich der Ergebnisse mit den Daten, die nur bei der Reaktion von P-Ribose und Adenin gewonnen wurden, wurden bei allen Reaktionen Veränderungen in der Isomerenverteilung von AMP beobachtet, außer im Fall von Tryptophan, was auf Konformationsbeschränkungen aufgrund des Vorhandenseins der Indol-basierten Seitenkette von Tryptophan zurückzuführen sein könnte. Bei der Analyse der cAMP-EICs wurden geringere Veränderungen in der relativen Intensität der isomeren Peaks festgestellt. Ein deutlicher Unterschied im EIC von Adenosin wurde jedoch nur bei den Reaktionen mit Phenylalanin und Threonin beobachtet.