Ergebnisse und Diskussion
Zwei Modi der DNA-Spaltung durch R.KpnI in Gegenwart von Mg2+.
R.KpnI ist im Gegensatz zu den meisten anderen REasen (11, 12) eine hochpromiskuitive REase in Mg2+-katalysierten Reaktionen. In Abb. 1 A ist das charakteristische Spaltmuster von R.KpnI in einer Reihe von Mg2+-Konzentrationen dargestellt. Bei niedrigeren Konzentrationen des Metallions (50-500 μM) wurde nur die Spaltung der kognaten Sequenz beobachtet (Spuren 2-5). Bei Mg2+-Konzentrationen von >500 μM war jedoch eine promiskuitive Spaltung zu beobachten (Spuren 6-9). Die spezifische und promiskuitive Art der Spaltung durch R.KpnI in Abhängigkeit von der Mg2+-Konzentration wurde durch die Analyse der Spaltung von Oligonukleotiden bestätigt. Das Oligonukleotid-Substrat, das die kanonische Sequenz enthält, wurde von R.KpnI selbst bei 20 μM Mg2+ effizient gespalten. Im Gegensatz dazu wurden die nicht-kanonischen Sequenzen erst bei >500 μM Mg2+ effizient gespalten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass R.KpnI zwei unterschiedliche Metallaktivierungsprofile aufweist – eines für kanonische und das andere für nicht-kanonische DNA-Substrate. Das Enzym folgt einem hyperbolischen Metallaktivierungsprofil für das kanonische Substrat und einem sigmoidalen Muster für das nicht-kanonische Substrat (Abb. 1 B). Diese Daten wurden einer Hill-Plot-Analyse unterzogen (Abb. S2; und siehe SI-Text), und der Hill-Koeffizient für die Metallionenbindung ist in Tabelle 1 dargestellt. Die Hill-Plot-Analyse zeigte die Bindung eines zusätzlichen Metallions an das Enzym und seine Rolle bei der Spaltung von nicht-kanonischen Sequenzen. Die Rekrutierung eines zusätzlichen Metallions in der Nähe des aktiven Zentrums des Enzyms oder weit davon entfernt scheint also notwendig zu sein, um eine promiskuitive Spaltung durch das Enzym zu induzieren. Wenn dies der Fall ist, sollte eine Mutation der an der Koordination des zweiten Metallions beteiligten Reste die promiskuitive Aktivität aufheben, was zu einem hochgradig sequenzspezifischen Enzym führt. Wir haben diese Hypothese getestet.