GFP
Green Fluorescent Protein (GFP) ist ein einzelnes Polypeptid-Genprodukt aus 238 Aminosäuren, das in der Qualle Aequorea victoria entdeckt wurde. Das Protein hat eine natürliche grüne Fluoreszenz unter bestimmten Beleuchtungsbedingungen. Das Protein erhält seine Biolumineszenz durch Ser-Tyr-Gly-Zyklisierung innerhalb seiner primären Aminosäuresequenz. GFP ist recht stabil und widersteht einer Reihe von chemischen Behandlungen und Verfahren.1 Der erste Nachweis, dass dieses fluoreszierende Protein in einem heterologen System exprimiert werden kann, wurde in C. elegans erbracht.2 GFP hat sich seitdem zu einem bevorzugten Reportergen entwickelt, da es keine biochemische Transformation, kein Kontrastmittel oder den Einsatz schädlicher ionisierender Strahlung erfordert, um sichtbar gemacht zu werden.3 Seit diesem ersten Bericht wurde über die Expression des GFP-Reportergens in zahlreichen Organismen, einschließlich Mäusen, berichtet.4 Darüber hinaus können transgene GFP-Mäuse unter der Steuerung eines spezifischen Promotors das fluoreszierende Protein gewebe- und sogar zellspezifisch exprimieren. Die nicht-invasive Visualisierung ist der Schlüssel zur Überwachung physiologischer und biochemischer Prozesse in vivo und in Echtzeit.5
Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, die Biolumineszenz von GFP zu visualisieren. Eine Möglichkeit, die Fluoreszenz nachzuweisen, ist mit einem handgehaltenen UV-Licht (365 nM). Es gibt mehrere Modelle, die von Fisher in einer Preisspanne von etwa 100 bis 200 $ angeboten werden. Die Methode mit dem UV-Handlicht funktioniert bei dem transgenen GFPX-Stamm (Stock 003116) nicht sehr gut. Dr. Andras Nagy, der die GFPX- und GFPU-Transgene (Stock 003115 und 003116) gespendet hat, beschreibt ein Betrachter-Headset und einen an das Mikroskop anpassbaren Filter, die jetzt im Handel erhältlich sind.
CFP und YFP
Neue Fortschritte haben die Eigenschaften und den Nutzen von GFP als Reportergen verbessert. Enhanced GFP (EGFP) wurde so entwickelt, dass es in Säugetierzellen in höherer Konzentration exprimiert wird und intensiver fluoresziert. Cyan fluoreszierendes Protein (CFP) und gelb fluoreszierendes Protein (YFP) sind spektrale Varianten von GFP, die es ermöglichen, mehrere Zelltypen gleichzeitig zu markieren.
Cubitt AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gross LA, Tsien RY. 1995. Verstehen, Verbessern und Verwenden von grün fluoreszierenden Proteinen. Trends Biochem Sci 20:448-55.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. 1994. Grün fluoreszierendes Protein als Marker für die Genexpression. Science 263:802-5.
Hoffman RM. 2002. Green fluorescent protein imaging of tumor cells in mice. Lab Animal 31(4): 34-41.
Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. 1997. ‚Green mice‘ as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett 407:313-9.
Yang M, Baranov E, Jiang P, Sun FX, Li XM, Li L, Hasegawa S, Bouvet M, Al-Tuwaijri M, Chishima T, Shimada H, Moossa AR, Penman S, Hoffman RM. 2000. Optische Ganzkörperdarstellung von grün fluoreszierenden Proteinen exprimierenden Tumoren und Metastasen. Proc Natl Acad Sci USA 97:1206-11.
lacZ
Die Verwendung eines Reportergens kann die Untersuchung räumlicher Muster der Genexpression eines bestimmten Promotors innerhalb eines Gewebes, eines Embryos oder einer erwachsenen Maus ermöglichen.1 Das E. coli lacZ-Gen kann, wenn es durch transgene Techniken in das Mausgenom integriert wird, als Reportergen unter der Kontrolle eines bestimmten Promotors/Enhancers in einer Transgenexpressionskassette verwendet werden. Das lacZ-Gen kodiert für Beta-Galaktosidase, die die Spaltung von Laktose in Galaktose und Glukose katalysiert. Die Beta-Galaktosidase-Aktivität kann sowohl durch In-situ- als auch durch In-vitro-Techniken nachgewiesen werden, wenn sie mit dem Beta-Galaktosidase-Substrat X-gal inkubiert wird. Beta-Galaktosidase spaltet X-gal, ein chromogenes Substrat, was zu einem unlöslichen blauen Farbstoff führt und somit die Identifizierung von Zellen mit lacZ-Aktivität ermöglicht.2 Transgene Tiere können dann verwendet werden, um Faktoren und Bedingungen zu identifizieren, die das Expressionsprofil des Promotors oder Enhancers modulieren.