DISKUSSION
Citrobacter ist eine wichtige Ursache für opportunistische Infektionen; C. diversus wird mit etwa 40 % der Fälle in Verbindung gebracht, während C. freundiire etwa 29 % ausmacht (11). Citrobacterspp. verursachen neonatale Meningitis und haben eine ungewöhnliche Neigung, Hirnabszesse zu verursachen (8, 14). Die Pathogenese von Citrobacter spp., die Meningitis und Hirnabszesse verursachen, ist nicht gut charakterisiert; wie bei anderen Meningitis verursachenden Bakterien muss jedoch eine Penetration der Blut-Hirn-Schranke stattfinden. Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um die potenziellen Interaktionen von Citrobacter mit der Blut-Hirn-Schranke besser zu verstehen. C. freundii wurde als Modellbakterium für diese Studien ausgewählt, da die Bakteriengenetik besser definiert ist und eine Genombibliothek für eventuelle Studien über die molekulare Grundlage der Invasion und Replikation von Citrobacter in HBMEC zur Verfügung steht. Experimente, die mit einem Liquorisolat von C. diversus durchgeführt wurden, ergaben ähnliche Ergebnisse (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die Häufigkeit und der Mechanismus der HBMEC-Invasion bei diesen beiden Spezies ähnlich sein könnten.
Die Blut-Hirn-Schranke ist eine komplexe Struktur, die aus dem Epithel des Plexus choroideus und dem Endothel der Hirnkapillaren besteht. Das Vorhandensein enger Verbindungen und die geringe pinozytotische Aktivität der Endothelzellen führen dazu, dass Makroelemente die Blut-Hirn-Schranke nicht passieren können. Derzeit ist nicht bekannt, an welcher Stelle der Blut-Hirn-Schranke C. freundii eindringt, aber es wurde festgestellt, dass der Plexus choroideus im Säuglingsrattenmodell der experimentellen hämatogenen Citrobacter-Meningitis nur selten betroffen ist (16). Darüber hinaus bedecken endotheliale mikrovaskuläre Zellen die größte Oberfläche der Blut-Hirn-Schranke, und es wurde gezeigt, dass andere Meningitis verursachende Bakterien in vitro in mikrovaskuläre Endothelzellen eindringen können (13, 20, 25). Wir wählten daher HBMEC für unsere Studie aus. Invasionstests in Gewebekulturen und TEM-Studien lieferten den Beweis, dass C. freundii in HBMEC eindringt. Die Ergebnisse von Invasionstests, die in Gegenwart verschiedener eukaryotischer Zellinhibitoren durchgeführt wurden, deuten darauf hin, dass die Invasion von C. freundii in HBMEC ein Prozess ist, der von Mikrofilamenten, Mikrotubuli, de novo-Proteinsynthese und Endosomenansäuerung abhängt. In ausgedehnten Invasionstests wurde festgestellt, dass C. freundii über längere Zeiträume in vitro überleben und sich intrazellulär vermehren kann. TEM-Analysen ergaben, dass sich einzelne und mehrere C. freundii-Zellen intrazellulär in vakuolenartigen Strukturen mit einer einzigen Membran befinden. Transwell-Experimente zeigten, dass C. freundii eine polarisierte Monoschicht aus HBMEC durchqueren konnte, während dies für nicht-invasive E. coli nicht möglich war. Außerdem zeigen unsere vorläufigen Daten, dass C. freundii die Blut-Hirn-Schranke im Modell der experimentellen hämatogenen Meningitis bei neugeborenen Ratten durchdringt (21). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass C. freundii in Vakuolen eindringt, sich möglicherweise repliziert, durch die HBMEC transzytiert, auf der basolateralen Seite freigesetzt wird und so die Blut-Hirn-Schranke durchdringt.
Über die Invasion eukaryontischer Zellen durch C. freundii wurde bereits berichtet (22, 35). Dies ist jedoch der erste Bericht über die Invasion von HBMEC durch C. freundii. Interessanterweise sind die eukaryotischen Voraussetzungen für die Invasion von C. freundii so vielfältig wie die Zelltypen, in die C. freundii nachweislich eindringt. So hat sich beispielsweise gezeigt, dass der Clathrin-beschichtete Pit-Inhibitor MDC die Invasion von C. freundii in allen anderen untersuchten Zelltypen (z. B. menschliche Gefäß-, Darm- und Blasenepithelzellen) hemmt, mit Ausnahme von HBMEC, wie in dieser Studie gezeigt. Darüber hinaus dringen andere bisher charakterisierte Meningitis verursachende Bakterien auf einem Weg in HBMEC ein, der von Mikrotubuli abhängt und MDC-empfindlich ist (20, 24, 27). Es hat sich gezeigt, dass die Clathrin-ummantelten Pit-Inhibitoren MDC und Ouabain nicht alle Rezeptoren hemmen; daher könnte es sein, dass der für die Invasion von C. freundii in HBMEC notwendige Rezeptor nicht durch den Inhibitor MDC oder Ouabain beeinflusst wird. Obwohl die bisher gesammelten Beweise darauf hindeuten, dass das Eindringen von C. freundii in HBMEC möglicherweise nicht über einen MDC- oder oabain-empfindlichen rezeptorvermittelten Weg erfolgt, scheint es, dass sowohl die Ansäuerung der Endosomen als auch die de novo-Proteinsynthese erforderlich sind. Die verfügbaren Daten legen zwei mögliche Szenarien nahe. Die Ansäuerung der Endosomen könnte als Umweltauslöser für das intrazelluläre bakterielle Überleben erforderlich sein. Ähnliche Voraussetzungen wurden für die Invasion von Salmonellen in Epithelien beschrieben (26). Alternativ dazu könnten Endosomenansäuerung und Proteinsynthese für die Abtrennung des Liganden-Rezeptor-Komplexes, die Synthese des Rezeptors und/oder die Präsentation des Rezeptors auf der HBMEC-Oberfläche erforderlich sein, damit die Invasion von C. freundii stattfinden kann. Das letztgenannte Szenario erinnert an andere invasive Krankheitserreger, bei denen der Kontakt mit dem lebensfähigen Organismus für die Modulation eukaryotischer Zelladhäsionsmoleküle erforderlich ist, die für die Invasion notwendig sind (z. B. Streptococcus pneumoniae und der Rezeptor für den Thrombozyten-aktivierenden Faktor) (2).
Invasionstests, die in Gegenwart von Mikrotubuli-Inhibitoren (sowohl depolymerisierende als auch stabilisierende Mittel) durchgeführt wurden, verringerten die Fähigkeit von HBMEC, C. freundii aufzunehmen, erheblich. Konfokale Mikroskopieexperimente mit Anti-α-Tubulin-Antikörpern zeigten, dass Mikrotubuli aggregieren, nachdem HBMEC mit C. freundii in Kontakt gekommen sind. Die Mikrotubuli-Aggregation war ein zeitabhängiger Prozess; nach 5 Minuten wurde keine Aggregation beobachtet, nach 15 Minuten nur noch wenig, und nach 30 Minuten Inkubation von C. freundii mit HBMEC wurde eine deutliche Aggregation beobachtet. Diese Mikrotubuli-Aggregation wurde gehemmt, wenn die Zellen entweder mit Mikrotubuli-Inhibitoren oder Mikrofilament-hemmenden Mitteln behandelt wurden. Interessant ist, dass das Färbemuster der Mikrotubuli-Aggregation nicht mit der bakteriellen Bindung kolokalisiert war und dass Bereiche von HBMEC, die keine C. freundii-Bindung aufwiesen, ebenfalls eine ausgeprägte Mikrotubuli-Verklumpung zeigten. Dies deutet darauf hin, dass der Kontakt der Bakterien mit HBMEC die Mikrotubuli-Aggregation global stimulieren kann. Ob die Mikrotubuli-Aggregation das Ergebnis eines sekretierten bakteriellen Faktors oder einer parakrinen Reaktion auf die Bindung der Bakterien an HBMEC ist, muss noch untersucht werden. Darüber hinaus könnte die Aggregation der Mikrotubuli als Reaktion auf die Bindung von C. freundii mit der postulierten Rezeptorpräsentation durch De-novo-Proteinsynthese und Endosomenansäuerung zusammenhängen. Es wurde bereits gezeigt, dass der Transport vieler Rezeptoren zur und von der Zelloberfläche von Mikrotubuli abhängig ist (10). Eine Erklärung für die hemmende Wirkung von Mikrotubuli-Inhibitoren auf das Eindringen von C. freundii in HBMEC ist daher, dass die Wirkstoffe möglicherweise die Anzahl der HBMEC-Rezeptoren verringern, die das Eindringen von C. freundii vermitteln. Experimente sind im Gange, um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden.
Mikrotubuli haben zuvor gezeigt, dass sie für die Invasion vieler Krankheitserreger erforderlich sind (z. B. Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, enteropathogene und enterohämorrhagische E. coli und Campylobacter jejuni (4, 9, 22, 23, 29). Allgemein wird davon ausgegangen, dass diese Krankheitserreger zwar über Mikrotubuli abhängige Wege eindringen können, sich aber in der Regel nicht intrazellulär vermehren (6). Die in dieser Studie aus ausgedehnten Invasionstests und TEM-Analysen gewonnenen Daten deuten darauf hin, dass C. freundii möglicherweise eine Ausnahme von dieser Verallgemeinerung darstellt. Im Gegensatz zu einem anderen intravakuolären Bakterium, Legionella pneumophila(12), wurden keine Mitochondrien oder Ribosomen in der Nähe der Bakterien gefunden. Dies deutet darauf hin, dass C. freundii diese Organellen möglicherweise nicht zur direkten Energiegewinnung nutzt oder dass die Rekrutierung spezifischer Wirtszellproteine für das intrazelluläre Überleben und die Vermehrung nicht erforderlich ist (wie im Fall von L. pneumophila). Von besonderer Bedeutung für Infektionen des Zentralnervensystems sind andere meningitisverursachende Bakterien wie E. coli K1, GBS und S. pneumoniae, von denen ebenfalls gezeigt wurde, dass sie in BMEC eindringen (1, 13, 25) oder in BMEC eindringen und diese transzytieren (20, 27); es wurde jedoch nicht festgestellt, dass sich diese Organismen in HBMEC replizieren. Wie oben beschrieben, ist die Citrobacter-Meningitis für ihre hohe Häufigkeit der Bildung von Hirnabszessen dokumentiert worden. Ob die Replikation in HBMEC-Vakuolen einzigartig für Citrobacter ist und ob es eine Korrelation mit der Abszessbildung gibt, muss noch ermittelt werden.
Cytochalasin D hemmt die Invasion von C. freundii in HBMEC; mit Hilfe von Immunfärbung fanden wir jedoch keine nachweisbare Reorganisation von Mikrofilamenten, wenn C. freundii mit HBMEC interagierte (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus hemmte die Vorbehandlung von HBMEC mit Cytochalsin D die bakterienabhängige Mikrotubuli-Aggregation, wie durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht wurde. Für diese Ergebnisse kann es mehrere Erklärungen geben. Die Wirkung von Cytochalsin D auf die bakterienabhängige Mikrotubuli-Aggregation könnte auf indirekte Effekte des Mikrofilament-Inhibitors auf das Mikrotubuli-Netzwerk zurückzuführen sein. So wurde beispielsweise beobachtet, dass Mikrotubuli als Verankerungsstrukturen für F-Actin fungieren (28). Daher könnte eine Unterbrechung des Mikrofilament-Netzwerks das Mikrotubuli-Netzwerk beeinträchtigen und somit indirekt die mikrotubuliabhängige Invasion von C. freundii in HBMEC beeinflussen. Alternativ könnte ein aktinabhängiger Invasionsschritt einem mikrotubuliabhängigen Schritt bei der Invasion von C. freundii in HBMEC vorausgehen. Dieser erste Schritt könnte zu einer Reorganisation der Mikrofilamente führen, wenn die Bakterien zum ersten Mal mit dem HBMEC in Kontakt kommen. Diese Ereignisse könnten jedoch vorübergehend sein, und die Versuchsanordnung mit Immunfluoreszenzmikroskopie könnte ihr Auftreten nicht angemessen erfassen. Ähnlich verhält es sich mit der Yersiniainvasin-vermittelten Invasion (36). Wenn also die Anfangsphase der Invasion durch Cytochalasin D verhindert wird, werden die nachfolgenden Phasen der Invasion, die von Mikrotubuli abhängig sind, nicht ausgelöst. Es wurde bereits gezeigt, dass Aktin bei der Verlagerung von aktinbindenden Proteinfaktoren zur Plasmamembran und bei der zytosolischen Signalübertragung eine Rolle spielt (19). Darüber hinaus hemmt Cytochalasin D den Eintritt von Salmonellen, indem es die Translokation von Aktin-bindenden Proteinen zur bakteriellen Eintrittsstelle unterbricht (7). Es ist möglich, dass im Falle der Invasion von C. freundii in HBMEC Aktin-Mikrofilamente für die zytosolische Signalübertragung und/oder die bakterielle Penetration an der Plasmamembran notwendig sind, und dass Mikrotubuli für den Transport membrangebundener Bakterien von der Plasmamembran zur basolateralen Seite (oder einfach tiefer in die Zelle) notwendig sein könnten. Eine Unterbrechung in einem der beiden Stadien der Invasion würde also zu einem „Stau“ führen.
Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Ergebnisse, dass C. freundii in HBMEC in vitro eindringen, sich darin vermehren und transzytieren kann. Die Bestimmung der genetischen Grundlage für diese Phänotypen wird wichtige Erkenntnisse über die Pathophysiologie der Citrobactermeningitis liefern und möglicherweise zur Entwicklung neuer therapeutischer und präventiver Strategien beitragen. Darüber hinaus könnte eine umfassende vergleichende molekulare Analyse von Citrobacter mit anderen Meningitis verursachenden Bakterien Licht auf die einzigartige Eigenschaft von Citrobacter zur Bildung von Hirnabszessen werfen.