Um das Jahr 1000 v. Chr. siedelte eine Welle von Einwanderern im oberen Tibertal bis zur Adria und auch in der Nähe von Assisi. Es handelte sich um die Umbrer, die in kleinen befestigten Siedlungen auf den Höhen lebten. Ab 450 v. Chr. wurden diese Siedlungen nach und nach von den Etruskern übernommen. Nach der Schlacht von Sentinum 295 v. Chr. übernahmen die Römer die Kontrolle über Mittelitalien. Sie errichteten das blühende Municipium Asisium auf einer Reihe von Terrassen auf dem Monte Subasio. Römische Überreste sind noch heute in Assisi zu finden: Stadtmauern, das Forum (heute Piazza del Comune), ein Theater, ein Amphitheater und der Tempel der Minerva (heute die Kirche Santa Maria sopra Minerva). 1997 wurden auch die Überreste einer römischen Villa entdeckt, die mehrere gut erhaltene Räume mit Fresken und Mosaiken enthält, wie man sie außerhalb von Pompei selten findet.
Im Jahr 238 n. Chr. wurde Assisi von Bischof Rufino zum Christentum bekehrt, der in Costano den Märtyrertod erlitt. Der Überlieferung nach ruhen seine sterblichen Überreste in der Kathedralkirche San Rufino in Assisi.
Die Ostgoten unter König Totila zerstörten im Jahr 545 den größten Teil der Stadt. Danach kam Assisi als Teil des langobardischen und dann fränkischen Herzogtums Spoleto unter die Herrschaft der Langobarden.
Die blühende Gemeinde wurde im 11. Jahrhundert eine unabhängige ghibellinische Gemeinde. Im ständigen Kampf mit den Guelfen von Perugia wurde Francesco di Bernardone (der heilige Franz von Assisi) in der Schlacht von Ponte San Giovanni gefangen genommen und setzte damit die Ereignisse in Gang, die ihn schließlich dazu brachten, als Bettler zu leben, der Welt zu entsagen und den Orden der Minderbrüder zu gründen.
Die Stadt, die innerhalb der römischen Mauern geblieben war, begann sich im 13. Zu dieser Zeit stand die Stadt unter päpstlicher Gerichtsbarkeit. Die Rocca Maggiore, die kaiserliche Festung auf dem Hügel über der Stadt, die 1189 vom Volk geplündert worden war, wurde 1367 auf Anordnung des päpstlichen Legaten, Kardinal Gil de Albornoz, wiederaufgebaut.
Anfänglich fiel Assisi unter die Herrschaft von Perugia und später unter mehrere Despoten, wie den Glücksritter Biordo Michelotti, Gian Galeazzo Visconti und seinen Nachfolger Francesco I. Sforza, Herzöge von Mailand, Jacopo Piccinino und Federico II. da Montefeltro, Herr von Urbino. Durch die Pest des Schwarzen Todes im Jahr 1348 geriet die Stadt in einen tiefen Niedergang.
Unter der Herrschaft von Papst Pius II. (1458-1464) kam die Stadt wieder unter päpstliche Gerichtsbarkeit.
Im Jahr 1569 wurde mit dem Bau der Basilika Santa Maria degli Angeli begonnen. Während der Renaissance und in späteren Jahrhunderten entwickelte sich die Stadt friedlich weiter, wie die Palazzi der Bernabei und Giacobetti aus dem 17. Jahrhundert bezeugen.
Assisi ist heute der Ort vieler Pilgerreisen und in der Legende mit seinem Sohn, dem heiligen Franziskus, verbunden. Der sanfte Heilige gründete den Franziskanerorden und wird zusammen mit der Heiligen Katharina von Siena als Schutzpatron Italiens verehrt. Vielen, auch Nichtchristen, ist er als Naturliebhaber in Erinnerung (seine Predigt vor einer Vogelschar ist eine der Legenden seines Lebens).
Assisi wurde von zwei verheerenden Erdbeben getroffen, die Umbrien im September 1997 erschütterten. Doch die Erholung und die Restaurierung sind bemerkenswert, auch wenn noch viel zu tun bleibt. Viele historische Stätten wurden stark beschädigt, aber die Hauptattraktion, die Basilica di San Francesco, wurde weniger als zwei Jahre später wiedereröffnet.