Eine Aufschlämmung von Harz, wie DEAE-Sephadex, wird in die Säule gegossen. Die verwendete Matrix ist unlöslich und enthält geladene Gruppen, die kovalent gebunden sind. Diese geladenen Gruppen werden als Austauscher wie Kationen- und Anionenaustauscher bezeichnet. Nach dem Absetzen wird die Säule in Puffer voräquilibriert, bevor die Proteinmischung aufgetragen wird. DEAE-Sephadex ist eine positiv geladene Aufschlämmung, die elektrostatische Wechselwirkungen mit den negativ geladenen Atomen eingeht, so dass diese später eluieren als die positiv geladenen Moleküle in der interessierenden Probe. Diese Trenntechnik wird häufig verwendet, um bestimmte Proteine oder Enzyme im Körper zu entdecken. Ungebundene Proteine werden im Durchfluss und/oder in nachfolgenden Pufferwaschungen gesammelt. Proteine, die an das positiv geladene Harz binden, werden zurückgehalten und können auf eine von zwei Arten eluiert werden. Zunächst wird die Salzkonzentration im Elutionspuffer schrittweise erhöht. Die negativen Ionen in der Salzlösung (z. B. Cl-) konkurrieren mit dem Protein bei der Bindung an das Harz. Zweitens kann der pH-Wert der Lösung allmählich gesenkt werden, was zu einer positiveren Ladung des Proteins führt, wodurch es vom Harz abgelöst wird. Beide Techniken können das negativ geladene Protein verdrängen, das dann in Reagenzglasfraktionen mit dem Puffer eluiert wird.
Die Trennung der Proteine hängt von den Unterschieden in der Gesamtladung ab. Die Zusammensetzung der ionisierbaren Seitenkettengruppen bestimmt die Gesamtladung des Proteins bei einem bestimmten pH-Wert. Am isoelektrischen Punkt (pI) ist die Gesamtladung des Proteins 0 und es bindet nicht an die Matrix. Liegt der pH-Wert über dem pI-Wert, ist das Protein negativ geladen und bindet an die Matrix in einer Anionenaustauschersäule. Die Stabilität des Proteins bei Werten über oder unter dem pI-Wert bestimmt, ob eine Anionenaustauschersäule oder eine Kationenaustauschersäule verwendet werden sollte. Wenn es bei pH-Werten unterhalb des pI stabil ist, sollte eine Kationenaustauschersäule verwendet werden. Ist es bei pH-Werten oberhalb des pI stabil, kann die Anionenaustauschersäule verwendet werden.