Um dos procedimentos mais importantes na virologia é a medição do título do vírus – a concentração de vírus numa amostra. Uma abordagem amplamente utilizada para determinar a quantidade de vírus infecciosos é o ensaio de placa bacteriana. Esta técnica foi inicialmente desenvolvida para calcular os títulos dos stocks de bacteriófagos. Renato Dulbecco modificou este procedimento em 1952 para uso em virologia animal, e desde então tem sido usado para a determinação confiável dos títulos de muitos vírus diferentes.
Para realizar um ensaio de placa, são preparadas diluições de 10 vezes um estoque de vírus, e alíquotas de 0,1 ml são inoculadas em monocamadas de células suscetíveis. Após um período de incubação, para permitir a ligação do vírus às células, as monocamadas são cobertas com um meio nutriente contendo uma substância, geralmente ágar, que causa a formação de um gel. Quando as placas são incubadas, as células infectadas originais libertam a descendência viral. A propagação dos novos vírus é restrita às células vizinhas pelo gel. Consequentemente, cada partícula infecciosa produz uma zona circular de células infectadas chamada placa. Eventualmente, a placa torna-se suficientemente grande para ser visível a olho nu. Os corantes que mancham as células vivas são frequentemente usados para realçar o contraste entre as células vivas e as placas. Apenas os vírus que causam danos visíveis nas células podem ser testados desta forma. Um exemplo de placas formadas por poliovírus em uma monocamada de células HeLa é mostrado à esquerda. Nesta imagem, as células foram coradas com violeta cristal, e as placas são facilmente visíveis onde as células foram destruídas por infecção viral.
O título de um estoque de vírus pode ser calculado em unidades formadoras de placas (PFU) por mililitro. Para determinar o título do vírus, as placas são contadas. Para minimizar o erro, apenas placas contendo entre 10 e 100 placas são contadas, dependendo do tamanho da placa de cultura celular que é utilizada. Os princípios estatísticos ditam que quando 100 placas são contadas, o título da amostra variará em mais ou menos 10%. Cada diluição é duplicada para aumentar a precisão. No exemplo abaixo, existem 17 placas na placa feitas a partir da diluição de 10-6. O título do estoque de vírus é portanto 1,7 x 108 PFU/ml.
Próximo vamos considerar como o ensaio da placa pode ser usado para preparar estoques de vírus clonais, um passo essencial para o estudo da genética viral.
Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Alguns problemas da virologia animal estudados pela técnica da placa bacteriana. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 273-279