Sinteza integrată a nucleotidelor și nucleozidelor influențate de aminoacizi

Formarea simultană a produșilor de glicozilare

Formarea structurilor de nucleozide și nucleotide din precursori simpli a fost realizată simultan cu trei nucleoaze prin reacții de deshidratare. Acest lucru este în contrast cu lucrările anterioare în acest domeniu, în care condițiile au fost optimizate pentru a favoriza produse specifice24,25,26. Într-un experiment tipic de glicozilare, adenina și P-riboza au fost încălzite la 90 °C timp de 5 h la pH 2,5. Am observat formarea nucleotidului adenină monofosfat (AMP) (și a izomerilor săi) atunci când adenina și P-riboza au fost combinate. Cromatogramele de ioni extrași (EIC) obținute în urma analizei HPLC-MS a produselor au evidențiat mai multe vârfuri cu m/z corespunzător + și + (Figurile suplimentare 13-15). Comparația cu standardele a confirmat faptul că AMP corespunde vârfului găsit la RT = 4,2 min (Figurile suplimentare 5, 6); alte vârfuri majore ar putea fi în concordanță cu izomerii AMP, cum ar fi izomerul N6-ribosilat. Pentru a confirma acest lucru, s-a efectuat o reacție de hidroliză în prezența NaOH (0,1 M), în încercarea de a diferenția între diferiți izomeri, având în vedere că izomerul N6-ribosilat este mai predispus la hidroliză. Cu toate acestea, se poate observa o ușoară perturbare a vârfurilor, ceea ce face dificilă confirmarea identității izomerului N6-ribosilat. Am analizat apoi doi etaloane puri a doi izomeri diferiți (adenozină 3′- monofosfat și adenozină 5′-monofosfat monohidrat) individual și în amestec pentru a elucida profilul de eluzie al izomerilor (figurile suplimentare 148, 149). Se poate observa o deplasare a timpului de retenție pentru amestecul standard care oferă o corelație mai bună cu eluția acestor compuși în proba reală. Deși este dificil de diferențiat între izomeri, putem confirma prezența a cel puțin doi izomeri în cadrul produselor AMP prin compararea profilului de eluție al amestecului standard cu proba reală. Acum este clar că formarea de izomeri diferiți (figura suplimentară 12) este un motiv posibil pentru eluția nucleotidelor cu aceleași mase la timpi de retenție diferiți. Mai mult, analiza MS/MS a produselor noastre de reacție relevă fragmentarea AMP (și a izomerilor săi) la adenină (m/z = 136,0617 ± 0,01) (Fig. suplimentară 20); acest lucru este în concordanță cu fragmentarea standardului canonic de AMP. Mecanismul de reacție propus de noi constă în formarea unei legături glicozidice între o grupare 1′-OH a ribozei și o grupare amino a adeninei (a se vedea Fig. suplimentară 12).

Reacțiile în timp arată că evaporarea apei este principala forță motrice pentru formarea produselor de glicozilare, prezentând o creștere semnificativă a formării structurilor de nucleozide și nucleotide în perioada de timp cuprinsă între 2 și 4 h (Fig. 2a). Acest interval de timp corespunde intervalului de timp în care volumul probei este redus drastic, iar reactivii sunt extrem de concentrați. După 5-6 h de reacție, proba ajunge la uscăciune și rata de reacție (urmată de intensitatea în măsurătorile HPLC-MS) se stabilizează. În plus față de AMP, produsele care conțin legături glicozidice, inclusiv nucleotide ciclice (de exemplu, AMPc)27 și nucleozide (de exemplu, adenozină), au fost detectate cu ajutorul RP-HPLC-MS, MS/MS și testate pentru formarea de derivați 1,N6-eteno28,29, confirmate prin comparație cu standardele (Fig. 2, figurile suplimentare 7-11, figurile suplimentare 23-27). Timpii de retenție ai standardelor canonice 2′,3′-cAMP și 3′,5′-cAMP nu au corespuns cu timpii de retenție ai vârfurilor EIC din probă. Cu toate acestea, distribuțiile de masă (+; +) și modelele de fragmentare (+) au fost identice (Figurile suplimentare 16-21). Aceste rezultate arată că, deși se formează structuri ciclice, cAMP canonic nu este produsul principal. Comparația cu un standard analitic de adenozină arată, de asemenea, că adenozina, împreună cu o serie de specii izomere, se formează în reacția de condensare a P-ribozei și adenozinei (figurile suplimentare 18-22). Deși formele canonice de AMP și adenozină au fost confirmate în aceste experimente, acestea nu au fost principalii produși în reacția de deshidratare.

Când fosfatul a fost furnizat separat sub formă de pirofosfat și a reacționat cu adenină și riboză, a fost detectat un compus cu masa adenozinei și a fost detectată o cantitate mică de AMP și cAMP, iar adenozina s-a format în continuare atunci când nu a fost prezentă nicio sursă de fosfat (figurile suplimentare 33-41). Este demn de remarcat faptul că ne-am concentrat în mod intenționat studiile asupra identificării produselor fosforilate (izomeri AMP și izomeri AMPc) și am acordat mai puțină atenție identificării produselor fosforilate care nu sunt izomeri AMP și izomeri AMPc30,31,32. Noi propunem formarea unei legături glicozidice între grupa hidroxil a ribozei și o grupă amino a adeninei, care este declanșată de pierderea unei molecule de apă prin evaporare. Reactivitatea relativă a grupărilor amină primară și secundară din adenină este bine studiată33 și, în absența activării sau a prezenței unei grupări protectoare, se preferă în mod normal legătura glicozidică la amina primară. Prin urmare, nu este de așteptat ca izomerul canonic al adenozinei/AMP să fie un produs major, deoarece ar necesita o reacție exclusiv la amina secundară. Cu toate acestea, reactivitatea este suficient de mare la nivelul aminei secundare pentru ca izomerii canonici să se formeze, deși nu ca produs principal. În alte nucleobaze, cum ar fi guanina, există și mai multe grupe amină accesibile, iar potențialul de produși izomeri este mai mare. Este probabil ca reactivitatea ribozei să fie predominant prin poziția anomerică, ceea ce duce la mai puțini izomeri posibili, deși pot fi observați și alți produși minori.

Reactivitatea altor nucleobaze canonice (citozină, guanină și timină) cu P-riboza a fost, de asemenea, investigată. S-au detectat mase corespunzătoare structurilor nucleozidice și nucleotidice în urma reacției de deshidratare a guaninei și citosinei cu P-riboză (Fig. 3 și fig. suplimentare 50-64). Structurile de glicozilare a guaninei s-au format într-o măsură relativ redusă, probabil din cauza solubilității limitate a guaninei la un pH scăzut. Cantitățile de produs măsurate pentru 5-metiluridin monofosfat de 5-metiluridină (m5UMP) și 5-metiluridină (nucleozida timinei) au fost chiar mai mici decât echivalentele lor din guanină și citozină (Fig. 3 și figurile suplimentare 65, 66). Aceste rezultate pot fi explicate prin prezența unei grupări amino primare în guanină și citosină, care lipsește în timină. Deși toate cele trei nucleobaze au grupări amină secundare, acestea sunt mai puțin reactive în formarea legăturilor glicozidice. Prin urmare, formarea structurilor nucleozidice și nucleotidice printr-o reacție de amină secundară, așa cum este necesar pentru a forma produse de glicozilare canonice, este defavorizată în cazul nucleobazelor în care sunt disponibile amine primare. Acest lucru are o implicație interesantă pentru adoptarea chimiei acizilor nucleici în originea vieții, deoarece sugerează că este posibil ca nucleotidele canonice să fi fost inițial nepotrivite până când au apărut alte mecanisme biochimice pentru a spori selectivitatea față de izomerii corecți. Prin urmare, așa cum era de așteptat, deși în experimentele noastre s-au format produși nucleotidici și nucleozidici canonici ai citosinei și guaninei, aceștia nu au corespuns vârfurilor principale observate (figurile suplimentare 42-49). Combinând aceste două observații (timpi de retenție diferiți, dar aceeași distribuție de masă ca și standardele canonice în EIC-uri), putem concluziona că speciile de nucleotide și nucleozide formate în urma reacției de deshidratare a guaninei/citozinei cu P-riboză au fost în principal specii izomere ale nucleotidelor și nucleozidelor canonice (unele structuri posibile sunt prezentate în Figurile Suplimentare. 50, 51).

În mod obișnuit, formarea structurilor de nucleotide a fost realizată în condiții specifice în funcție de nucleobaza utilizată, vizând un produs de reacție specific. Într-o abordare alternativă, am decis să includem mai multe nucleoaze simultan în reacția cu P-riboză. Scopul nostru a fost de a determina dacă formarea de produse cu mai multe nucleoaze în aceleași condiții de reacție ar da un amestec de produse sau ar fi dominată de unul singur. Această reacție a fost realizată prin includerea simultană a două sau trei nucleoaze (adenină, guanină și citosină) în vasul de reacție, împreună cu P-riboză. S-a obținut un amestec de produși de glicozilare, cuprinzând nucleotide (AMP, GMP și CMP), precum și nucleotidele ciclice respective (cAMP, cGMP și cCMP) și produșii nucleozidici (adenozină, guanozină și ctidină) (figurile suplimentare 67-95). Produșii de glicozilare ai guaninei s-au format cu un randament mai scăzut decât cei ai adeninei și citosinei, așa cum era de așteptat datorită solubilității scăzute a guaninei în condiții acide.

Schimbul de nucleo baze

S-a observat un schimb de nucleo baze atunci când Na+AMP a fost încălzit timp de 5 h la 90 °C în mediu apos acid cu citosină sau guanină. Schimbul de nucleo baze a dus la formarea de structuri nucleotide (CMP sau GMP), nucleotide ciclice (cCMP sau cGMP) și nucleozide (citodină sau guanozină) (a se vedea figurile suplimentare 96-102 și tabelul suplimentar 1 pentru randamente semicantitative). În acest experiment, CMP și ctidina au prezentat o tendință de creștere a intensității, în timp ce cCMP a atins o intensitate maximă atunci când a fost de 12,5 mM și apoi a scăzut până la o intensitate de 4,0 × 104 UA (Fig. Suplimentare 102a și 155-158). La o concentrație de citosină de 37,5 mM, s-a constatat că compusul cu cea mai mare intensitate este CMP, iar intensitățile măsurate pentru cCMP și ctidină au fost aproape identice. Două specii izomere principale au fost observate în EIC-urile de CMP și cCMP. Masele +, + și + au fost detectate în cazul CMP, în timp ce cCMP a prezentat +, + și + în cadrul distribuțiilor de masă respective. În cazul citidinei, + a fost principalul vârf detectat. Aceste distribuții de masă au coincis cu cea observată în cazul standardelor. Cu toate acestea, timpul de retenție al principalilor izomeri nu a corespuns cu cel al CMP și al ctidinei canonice. Atunci când AMP a reacționat cu concentrații din ce în ce mai mari de guanină (Fig. suplimentară 102b), toți cei trei produse de glicozilare (GMP, cGMP și guanosină) au atins o valoare maximă atunci când concentrația de guanină a fost de 2,5 mM (Fig. suplimentare 160-162). Aceste rezultate au fost consecința solubilității limitate a guaninei la pH-ul acid, astfel, chiar dacă s-a adăugat mai multă guanină în vasul de reacție, concentrația efectivă în soluție a fost aceeași. După valoarea maximă, intensitatea de cGMP și guanozină a fost constantă, din cauza solubilității slabe a guaninei. A fost observată doar o mică creștere a intensității tuturor celor trei produși de glicozilare a guaninei atunci când = 37,5 mM, ceea ce ar putea fi legat de o prezență mai mare a guaninei în soluție datorită concentrației ridicate adăugate. În EIC al GMP, s-a observat o zonă largă fără vârfuri bine definite, deși s-au evidențiat două vârfuri principale. + a fost singura specie chimică, legată de compușii guaninei, detectată în distribuția de masă pe EIC-ul său. Patru vârfuri, grupate în perechi, au fost observate atunci când EIC al cGMP a fost extras din datele MS, iar distribuția de masă a arătat speciile + și +. Pe de altă parte, EIC al guanozinei a prezentat trei vârfuri, dintre care cel mai intens a arătat prezența + în distribuția sa de masă.

Formarea produselor de glicozilare a citosinei și guaninei a demonstrat că a avut loc scindarea legăturii glicozidice a AMP în condițiile noastre de reacție. Atunci când au fost analizate EIC-urile de AMP, cAMP și adenozină, s-au observat mai multe vârfuri în fiecare cromatogramă, susținând teoria conform căreia legăturile glicozidice suferă hidroliză/formare dinamică în timpul reacției de deshidratare34. De asemenea, au fost investigate reacțiile nucleotidelor citozină și guanină cu adenină. În cazul reacției de deshidratare a CMP și a adeninei, nu s-a putut observa niciun produs corespunzător schimbului de nucleoaze (figurile suplimentare 103-108/a). Cu toate acestea, produsele de glicozilare a adeninei au fost clar detectate în cazul reacției GMP cu adenină (figurile suplimentare 105-108/b). Acest lucru se datorează faptului că hidroliza legăturilor glicozidice în GMP este mai ușoară decât în cazul CMP, în aceleași condiții de reacție34. Am efectuat, de asemenea, reacția de schimb de nucleoaze cu UMP și adenină, pentru a compara cu analogul pirimidinic direct al adeninei (Fig. suplimentară 109). Rezultatele au fost mai asemănătoare cu randamentele CMP prezentate în Fig. Suplimentară 108, decât cu randamentele GMP, obținându-se un randament foarte scăzut pentru produsele de glicozilare a adeninei în reacția UMP, care nu este suficient pentru a permite detectarea AMP și cAMP.

Efectul aminoacizilor asupra distribuției produselor de glicozilare

După cum s-a menționat anterior, aminoacizii, nucleotidele și blocurile lor de construcție ar fi putut fi prezente pe Pământul timpuriu în același timp. Prin urmare, produsele unei reacții de copolimerizare, sau chiar produsele rezultate în urma unui anumit efect catalitic al unui tip de polimer asupra celuilalt, ar fi putut apărea într-un mediu prebiotic. Pentru a studia co-reactivitatea blocurilor de construcție nucleotide și aminoacizi într-o deshidratare într-un singur vas, glicina, cel mai simplu aminoacid, a fost inclusă în reacțiile de deshidratare a P-ribozei și a nucleobazelor respective. Încorporarea glicinei a avut un efect clar asupra formării produselor de glicozilare, determinând scăderea randamentului global al produselor cu masa de izomeri AMP, izomeri cAMP și adenozină (Fig. 4a și fig. suplimentare 28-32). Acest lucru indică faptul că glicina joacă un rol fie în consumarea blocurilor de construcție ale nucleotidelor (P-riboză și/sau adenină) printr-o reacție secundară, fie că se atașează la structura produsului, modificându-i masa. Analiza EIC pentru aceste reacții relevă vârfuri care corespund masei produșilor de adaos de glicină (adică AMP-Gly, cAMP-Gly, adenozină-Gly și adenină-Gly) (figurile suplimentare 115-122), deși acești produși secundari nu se formează în cantitate suficientă pentru a explica toate modificările observate. Adductorii glicinei au fost, de asemenea, confirmați prin utilizarea glicinei deuterate ca material de plecare împreună cu P-riboză și adenină, ceea ce a cauzat modificări în distribuția izotopică a maselor de aduct (Figurile suplimentare 123, 124). S-a obținut un randament maxim semicantitativ de 59 % pentru formarea produselor de glicozilare (izomeri AMP, izomeri AMP ciclic și adenozină) în reacția dintre P-riboză și adenină; cu toate acestea, s-a obținut un randament de numai 46 % atunci când glicina a fost, de asemenea, prezentă în mediul de reacție (Fig. Suplimentară 144). Cuantificarea randamentelor pentru toți izomerii individuali posibili este dificil din punct de vedere tehnic, dar au putut fi determinate randamentele semicantitative ale unor izomeri folosind standarde pure: Adenozina 5′-monofosfat și adenozina 2′,3′-monofosfat ciclic au fost găsite la 38,7% și, respectiv, 18,2%, în absența glicinei, în timp ce randamentul în prezența glicinei s-a dovedit a fi semnificativ scăzut (<2%) pentru ambii izomeri.

Glicina a afectat, de asemenea, distribuția speciilor izomere și s-au observat diferențe clare în comparație cu cromatograma vârfului de bază (BPC) din reacția dintre P-riboză și adenină, în prezența și absența glicinei (Fig. 4b și Fig. Suplimentare 110-114). Aceste date au indicat prezența unor specii chimice diferite și o modificare rezultată a distribuției de masă între reacțiile cu și fără glicină. Au fost apoi analizate EIC-uri individuale pentru fiecare produs de glicozilare a adeninei, ceea ce a dus la observarea unor diferențe clare în intensitățile relative ale vârfurilor atunci când s-a adăugat glicină. Aceste rezultate arată în mod clar că glicina are un efect selectiv asupra speciilor izomere care se formează în mod preferențial. Se știe că glicina reacționează cu ușurință cu alte amine în condiții de deshidratare12 și este posibil să reacționeze cu aminele primare ale bazelor nucleare. Produsele secundare hibride care includ glicina (Gly-AMP, Gly-cAMP, Gly-Adenosină, Gly-Adenină) au fost detectate cu un randament de ~1% (Fig. Suplimentară 145), cu toate acestea, acest procent mic are un efect important asupra distribuției izomerice a produselor de glicozilare a adeninei (a se vedea Figurile Suplimentare 146, 147). S-a detectat o schimbare în distribuția izotopică a maselor produselor hibride (Fig. Suplimentare 123, 124) atunci când glicina deuterată a fost inclusă în reacția de deshidratare, confirmând includerea glicinei în structurile hibride.

Un efect similar asupra distribuției izomerilor a fost observat, de asemenea, atunci când P-riboza a reacționat cu citosina/guanina în prezența glicinei (Fig. 4c, Fig. Suplimentare 125-140). Intensitățile maxime ale diferitelor specii de izomeri au scăzut (GMP, CMP, cGMP, cCMP, guanozină și ctidină), în timp ce distribuția intensităților relative a fost, de asemenea, afectată. Diferențele dintre experimente au fost verificate în mod riguros folosind o metodă statistică precum analiza cluster a datelor EIC pentru a segmenta probele, în prezența și absența glicinei, în grupuri constitutive/clustere cu caracteristici comune (Fig. 5). Obiectivul analizei cluster în acest studiu este de a grupa datele (de exemplu, formarea structurii nucleotidelor și nucleozidelor) în ansambluri constitutive cu caracteristici comune (de exemplu, adăugarea de glicină față de absența glicinei). Această analiză ar trebui să demonstreze o omogenitate internă ridicată în cadrul clusterelor/grupurilor și o eterogenitate externă ridicată între clustere/grupuri. Fig. 5 prezintă o dendrogramă cu legătura „Wards „35. Pentru a identifica clusterele în dendrogramă, am colorat spectrele în funcție de prezența glicinei (glicină – roșu, fără glicină – negru, gol – albastru). După cum se poate observa, eșantioanele care conțin glicină se grupează. Un grup corespunde P-riboză + adenină + glicină (trei probe), care este separat de probele fără glicină. Un al doilea grup corespunde P-riboză + guanină + glicină și P-riboză + citosină + glicină. Probele care conțin adenină se separă într-un cluster mai mare care se distinge de celelalte probe, ceea ce indică o influență puternică a adeninei în reacție. Într-adevăr, există o serie de alți produși și reacții posibile care ar putea avea loc în condițiile de reacție efectuate (a se vedea Nota suplimentară 1 și Figurile suplimentare 150-162 pentru mai multe detalii).

Alți aminoacizi au fost, de asemenea, incluși în reacția de deshidratare a adeninei cu P-riboză pentru a testa dacă aceștia ar avea, de asemenea, un anumit efect asupra distribuției izomerice a produselor de glicozilare (Figurile suplimentare 141-143). Cei șase aminoacizi selectați pentru acest studiu (arginină, acid glutamic, treonină, metionină, fenilalanină și triptofan) au lanțuri laterale diferite, cu naturi chimice și grupe funcționale diferite. Atunci când rezultatele au fost comparate cu datele obținute din reacția doar a P-ribozei și adeninei, s-au observat modificări în distribuția izomerică a AMP în toate reacțiile, cu excepția cazului triptofanului, care ar putea fi atribuită unor limitări conformaționale datorate prezenței lanțului lateral pe bază de indol al triptofanului. Analizând EIC-urile AMPc, s-au observat schimbări mai mici în intensitatea relativă a vârfurilor izomerice. Cu toate acestea, s-a observat o diferență clară în EIC de adenozină doar pentru reacțiile care includ fenilalanina și treonina.

.