PMC

Printre mamifere, autotomia pare să fi evoluat de mai multe ori, dar din punct de vedere taxonomic este rară. Autotomia documentată este, de obicei, limitată la coadă și se produce prin pierderea tecii cozii (autotomie falsă) sau prin ruperea prin ruperea vertebrelor (autotomie adevărată)2,5. Pe lângă autotomia cozii, s-a făcut referire ocazional la speciile de mamifere cu piele slabă sau fragilă, deși nu se știe dacă aceste animale sunt capabile de autotomie cutanată. Astfel, am căutat mai întâi să investigăm dovezile anecdotice conform cărora două specii de șoareci spinoși africani (Acomys kempi și Acomys percivali) își scot cu ușurință porțiuni din piele ca un comportament de scăpare de prădători.

Pentru a testa ipoteza că A. kempi și A. percivali sunt capabile de autotomie cutanată, am prins cu capcana vie indivizi pe stânci (kopjes) în centrul Kenyei. În plus față de firele de păr de gardă, speciile din genul Acomys se remarcă prin prezența unor fire de păr asemănătoare spinării pe partea dorsală (Fig. 1a, b). Manipularea ambelor specii pe teren a confirmat faptul că mișcarea viguroasă a dus adesea la ruperea pielii. Rupturile au avut ca rezultat răni deschise mari sau pierderi de piele, de la bucăți mici până la zone care reprezentau aproximativ 60% din suprafața dorsală totală (Fig. 1c). În plus față de pierderea tegumentară, ambele specii au prezentat autotomie a tecii cozii, așa cum s-a raportat anterior pentru alte specii de Acomys, iar indivizii au fost adesea capturați cu coada lipsă2. În rândul indivizilor din captivitate, am observat că rănile cutanate severe se vindecă rapid, iar regenerarea rapidă a firelor de păr spinoase a ascuns complet zona rănită (Fig. 1d, e). Indivizii capturați pe teren au prezentat o vindecare similară și, în unele cazuri, foliculi de păr cu model în anagen (adică în faza de creștere) care păreau să se fi regenerat în zonele rănite (Fig. 1f).

Pentru a evalua modul în care pielea Acomys se rupe atât de ușor, ne-am întrebat dacă proprietățile mecanice ale pielii Acomys ar putea sta la baza slăbiciunii sale observate. Pe baza experimentelor de investigare a autotomiei pielii la geckos3, pielea slabă (adică pielea care posedă proprietăți structurale uniforme și care cedează sau se rupe sub o sarcină indusă relativ scăzută) poate fi diferențiată de pielea fragilă (adică pielea care posedă caracterizări morfologice specifice, cum ar fi un plan de fractură care permite eliberarea straturilor exterioare). Pentru a evalua fragilitatea pielii, am comparat proprietățile mecanice ale pielii Acomys și Mus. În timpul încărcării mecanice, pielea Mus a prezentat proprietăți elastice înainte de rupere, în timp ce pielea Acomys a fost fragilă și a început să se rupă la scurt timp după ce a fost aplicată sarcina (Fig. 2a). Am derivat curbele tensiune-deformare din pielea dorsală pentru a determina rezistența medie la tracțiune (σm) și am constatat că pielea Mus era de 20 de ori mai rezistentă decât pielea Acomys (2,3 MPa ± 0,19 și 0,11 MPa ± 0,03) (Fig. 2a, b). În cele din urmă, calculând tenacitatea medie (W), a fost necesară o energie de aproape 77 de ori mai mare pentru a rupe pielea Mus în comparație cu pielea Acomys (Fig. 2b). Aceste rezultate demonstrează că Acomys posedă o piele care se sfâșie (sau se rupe) cu ușurință ca răspuns la o tensiune scăzută aplicată și oferă o bază mecanică pentru slăbiciunea pielii lor.

Pentru a evalua dacă proprietățile structurale ale pielii Acomys au contribuit la slăbiciunea sa mecanică, am examinat caracteristicile celulare ale pielii lui A. percivali și am constatat că aceasta era comparabilă din punct de vedere anatomic cu cea a lui Mus și a altor rozătoare, deși cu foliculii de păr mult mai mari (Fig. 2c, d). Nu am găsit nicio dovadă a unui plan de fractură, care este mecanismul de autonomie a pielii la geckos și skinks3. Examinând fibrele de elastină, care sporesc elasticitatea pielii, am constatat că toate cele trei specii posedau o distribuție și o abundență similară de elastină în dermă și sub panicul carnosus (Fig. S1a-f). Am testat dacă foliculii de păr mai mari din pielea Acomys au redus suprafața dermică totală ocupată de țesutul conjunctiv, examinând proporția de anexe (de exemplu, foliculii și glandele asociate) în cadrul dermului și am constatat că aceasta a fost mai mare la A. percivali (55,61% ±4,28) în comparație cu M. musculus (43,65% ±4,62) (t=1,9, P=0,043) (Fig. 2e, f). Aceste constatări sugerează că, deși structura tisulară de bază a pielii Acomys este similară cu cea a mușchiului, spațiul ocupat de anexe în dermă reduce conținutul absolut de țesut conjunctiv, contribuind potențial la scăderea elasticității și la o rezistență mai mică la tracțiune atunci când pielea este pusă sub tensiune6. Lipsa unui plan de fractură subliniază această constatare și susține o diferență structurală inerentă care stă la baza slăbiciunii observate a pielii Acomys.

Dată slăbiciunea structurală inerentă și tendința de a se rupe, am evaluat capacitatea Acomys de a vindeca rănile cutanate folosind răni mici (4 mm) și mari (1,5 cm), răni excizionale de grosime totală (FTE). În cazul rănilor de ambele dimensiuni, formarea crustei și hemostaza au fost rapide și, în cazul rănilor mari, au contribuit la o reducere de 64% ±3,1 a suprafeței rănilor la 24 de ore după rănire (Fig. S2a). În timpul vindecării fără cicatrice la salamandrele terestre7 și la fetușii de mamifere8, patul rănii este reepitelizat în câteva zile, în timp ce o rană de 4 mm în pielea șobolanului adult are nevoie de 5-7 zile pentru a se reepiteliza9. La Acomys, am constatat că cinci din șase răni de 4 mm s-au reepitelizat complet până în a treia zi după rănire (D3), în timp ce rănile Mus nu au reușit să se reepitelizeze atât de repede (Fig. 2g, h). După reepitelizare, mamiferele cu pielea lăsată (de exemplu, rozătoarele, iepurii etc.) se bazează în principal pe contracție pentru a-și vindeca rănile10. În mod similar, am observat rate ridicate de contracție, care au reprezentat 95% din închiderea rănilor după 17 zile (Fig. S2a-c). Spre deosebire de cicatrizare, unde fibrele de colagen se organizează într-o rețea densă paralelă cu epiderma, în timpul vindecării fără cicatrice, fibrele de colagen adoptă un model similar cu dermul nevătămat10. Examinând matricea extracelulară (ECM) la D10, am observat cicatrizarea la Mus, în timp ce la Acomys, fibrilele de colagen erau mai puțin compacte și conțineau o structură mai poroasă (Fig. 2i, j). Folosind roșu picrosirius, am constatat că tipul I de colagen predomina în patul rănii la D10 la Mus, în timp ce tipul III de colagen era mai abundent la Acomys (Fig. 2k, l). Această diferență a fost și mai pronunțată în cazul rănilor de 1,5 cm (Fig. S3a-b’). Împreună, aceste date arată că reepitelizarea rapidă și contracția marginii plăgii reduc foarte mult dimensiunea rupturilor cutanate deschise la Acomys. Constatările noastre, conform cărora ECM-ul plăgii (1) se depune lent, (2) are o configurație poroasă și (3) este dominat de colagen de tip III, sugerează că această compoziție favorizează regenerarea în detrimentul fibrozei în timpul reparării pielii la Acomys.

Pentru a testa capacitatea de regenerare a mediului plăgii, am prelevat probe de răni mari în curs de vindecare pentru a găsi dovezi de neogeneză a foliculilor de păr și de regenerare dermică. În asociere cu ECM-ul mai poros, am observat geneza foliculară a firelor de păr de pelaj normale și a firelor de păr spinoase mari în patul rănii între D21 și D28 și am putut distinge foliculii vechi, mari, în apropierea marginilor rănii, de foliculii nou regenerate în patul rănii (Fig. 3a-d și Fig. S3c-e). Foliculii noi păreau să se regenereze în întreaga porțiune necontractată a patului rănii, nu doar în regiunea centrală (Fig. 3c și Fig. S3e) și am observat foliculii de păr în regenerare în diferite stadii de dezvoltare (Fig. 3a-m și Fig. S4a-c). O populație localizată și foarte proliferativă de celule epidermice conduce dezvoltarea foliculilor de păr și am observat un fenomen similar în timpul regenerării foliculilor (Fig. 3e și Fig. S4a-c). Pentru a investiga dacă rețelele de semnalizare embrionară utilizate în timpul dezvoltării foliculului pilos au fost desfășurate în timpul regenerării foliculului pilos, am examinat Keratina-17 (Krt17); care este exprimată în mod difuz în epidermă în timpul dezvoltării pielii și devine progresiv restrânsă la foliculii piloși în curs de dezvoltare11. În urma reepitelizării, KRT17 a fost puternic îmbogățită în tot neepidermul care acoperă patul rănii la D14 și, pe măsură ce s-au format noi foliculi de păr în patul rănii, KRT17 a devenit restrânsă la epiteliul folicular (Fig. 3f și Fig. S5). În timpul reparării rănilor la Mus, am constatat că KRT17 a fost, de asemenea, foarte crescut în epiderma reepitelizată la D14 (Fig. S5) și, deși KRT17 s-a localizat la unele keratinocite bazale în epiderma Mus la D21, aceste situsuri nu au reușit să se agregheze în placode sau în noi foliculi de păr, astfel încât KRT17 a fost complet absent din noua epidermă până la D26 (Fig. 3f). Dispariția KRT17 din keratinocitele bazale din Mus, împreună cu observația noastră de localizare continuă în noile placode și foliculi de păr la Acomys, sugerează că semnalele dermice subiacente necesare pentru a induce formarea placodelor în Mus lipsesc.

Deși semnalul precis pentru formarea placodei rămâne obscur, există o cerință absolută pentru semnalizarea Wnt în timpul formării normale a foliculilor12. Localizarea nucleară a proteinei LEF1 a fost utilizată ca o citire a acestei semnalizări inductive13. Am detectat acumularea nucleară a LEF1 în placodele epidermice care se regenerează, în fibroblastele dermice care se condensează sub germenul de păr și în papila dermică și în celulele matriciale (Fig. 3g, h și Fig. S6a). Am detectat, de asemenea, colorarea nucleară LEF1 la niveluri scăzute în unele keratinocite bazale care nu fac parte din placode, în timp ce nu am detectat LEF1 nuclear în epidermă în timpul vindecării rănilor la Mus, ceea ce sugerează că activarea Wnt epidermică la Acomys poate sta parțial la baza observației noastre de regenerare a foliculului pilos (Fig. S6b, c).

Reglementarea semnalizării canonice Bmp joacă, de asemenea, un rol în timpul inducerii foliculului pilos și diferențierii populațiilor de progenitori foliculari în foliculul pilos matur (revizuit în14). Fosforilarea SMAD-urilor 1, 5 și 8 (pSMAD1/5/8) este o citire robustă a semnalizării canonice Bmp. Am detectat pSMAD1/5/8 la niveluri scăzute în timpul inducerii foliculului și, ulterior, la niveluri mai ridicate în papila dermică și în celulele matriciale în curs de diferențiere în bulbul de păr (Fig. 3i, j). În plus, am detectat papila dermică SOX2 pozitivă în unii foliculi de păr în curs de regenerare, ceea ce este în concordanță cu rolul său în specificarea diferitelor tipuri de păr în timpul dezvoltării foliculilor de păr la șoareci15 (Fig. 3k). Luate împreună, aceste rezultate demonstrează că foliculii de păr regeneranți din Acomys trec prin etape definite de dezvoltare a foliculilor de păr, prezintă rate ridicate de proliferare și redesfășoară căile moleculare utilizate în timpul dezvoltării foliculilor de păr embrionari pentru a regenera noi foliculi de păr.

Pelea mamiferelor adulte este în mod normal incapabilă să regenereze structurile derivate din epidermă ca răspuns la rănire (de exemplu, glandele și foliculii de păr). O excepție în acest sens este observarea genezei foliculare spontane în răni mari de excizie la iepuri și, mai recent, la șoarecii de laborator (C57BL6/SJ, SJL sau tulpina mixtă)16,17,18. Iepurii sunt, de asemenea, una dintre puținele specii de mamifere capabile să regenereze răni mari provocate de perforarea urechii19. Am emis ipoteza că capacitatea de regenerare observată la Acomys s-ar putea extinde și la țesutul urechii lor. Pentru a testa acest lucru, am făcut perforații de 4 mm în urechile ambelor specii de Acomys și, spre surprinderea noastră, am constatat că acestea erau capabile să închidă aceste perforații mari (Fig. 4a-c și Fig. S7a-c). Țesutul urechii nevătămate conține piele (epidermă și dermă), foliculii de păr asociați, celule adipoase, mușchi și cartilaj; am constatat că Acomys au fost capabile să regenereze complet toate aceste țesuturi cu o fidelitate ridicată, cu excepția mușchiului (Fig. 4b-c). La douăsprezece zile după rănire, am observat o acumulare de celule în jurul circumferinței plăgii sub epidermă și, deși regenerarea de țesut nou a fost centripetă, celulele s-au acumulat într-o măsură mai mare pe partea proximală a pumnului. Regenerarea foliculilor de păr și a cartilajului s-a desfășurat într-un val de la proximal la distal (Fig. 4d, e) și, la fel ca în cazul pielii, epiderma foliculară din ureche a activat semnalizarea Wnt (Fig. S6d, e). Spre deosebire de Acomys, am constatat că Mus au fost incapabili să regenereze perforații de 4 mm în ureche și, în schimb, au format țesut cicatricial (Fig. S8a, b). Interesant, în ciuda formării cicatricilor, repararea urechii Mus a dus la formarea de novo a condensărilor de cartilaj distale față de cartilajul tăiat, sugerând că Mus ar putea iniția, dar nu menține, un răspuns regenerativ după rănirea urechii (Fig, S8b).

Rămâne neclar dacă regenerarea mamiferelor procedează prin formarea unei blasteme sau dacă este, în schimb, o versiune exagerată a creșterii hiperplastice20,21,22. Formarea blastemei este considerată un semn distinctiv al regenerării epimorfe. O caracteristică a blastemei de regenerare este că aceasta conține celule proliferante și menține proliferarea în timpul regenerării23. Am observat o proliferare larg răspândită în toată regenerarea urechii la Acomys și, în mod surprinzător, în tot țesutul urechii în curs de vindecare la Mus (Fig. 4f, g). Cu toate acestea, am observat o lipsă de proliferare în epiderma distală a lui Acomys, în timp ce am detectat proliferare în toată epiderma lui Mus, care se extinde până la vârful distal (Fig. 4f, g). În timp ce proliferarea a fost menținută în urechile Acomys, nu am observat aproape nicio celulă proliferantă în urechile Mus în stadii ulterioare (Fig. 4h, i).

O a doua caracteristică a unei blasteme este formarea unui centru de semnalizare epidermică specializat (epiderma rănită), care este necesară pentru ca celulele blastemale proliferante să rămână în ciclul celular24 și este caracterizată de o pierdere a stratificării epidermice, pierderea polarității keratinocitelor bazale și lipsa unei lamine bazale mature25. În urma reepitelizării la Acomys, am observat o îngroșare a epidermei distale, o dezorganizare a keratinocitelor bazale și absența unei membrane bazale mature (Fig. 4j). Comparativ, epiderma din apropierea planului de amputare a prezentat o stratificare normală și a posedat o membrană bazală proeminentă (Fig. 4k). În schimb, Mus a părut să formeze o epidermă de rană doar în mod tranzitoriu în urma reepitelizării, o zonă distală proporțional mai mică prezentând aceste caracteristici pentru o perioadă scurtă de timp (datele nu sunt prezentate). La D12 la Mus, colorarea colagenului de tip IV a dezvăluit o membrană bazală matură sub întreaga epidermă a urechii în curs de vindecare (Fig. 4l). În plus, epiderma prezenta o stratificare normală și o polaritate apical-bazală adecvată a keratinocitelor bazale (Fig. 4g, l).

În plus față de proliferarea susținută și formarea epidermei rănite, moleculele matricei extracelulare (ECM) joacă un rol esențial în susținerea proliferării și direcționarea diferențierii ulterioare în timpul regenerării26. În schimb, molecule precum laminina și colagenul de tip I, care favorizează diferențierea, sunt reglate în blastema în timpul regenerării membrelor amfibiene și sunt exprimate pe măsură ce are loc diferențierea sistemului musculo-scheletic26,27. Examinarea histologică a urechilor Acomys la D12 a evidențiat niveluri ridicate de fibronectină (FN), unele tenascine-C (TN-C) care înconjoară celulele dens împachetate, dar niveluri foarte scăzute de colagen de tip I (Fig. S9a-c). Colagenul de tip III a fost, de asemenea, mai abundent decât colagenul de tip I în timpul regenerării (Fig. S9d-d’). TN-C s-a restrâns din zonele în care noul cartilaj a început să se diferențieze, iar în cadrul acestor celule de diferențiere am constatat activarea căii de semnalizare Bmp în celulele care dau naștere noului cartilaj auricular (Fig. 4o și Fig. S10). În timpul creșterii hiperplastice în urechile Mus, ECM a prezentat inițial niveluri ridicate de FN și niveluri scăzute de TN-C, la fel ca în cazul urechilor Acomys, dar a produs niveluri relativ mai ridicate de colagen de tip I (Fig. S9e-g). Producția de colagen la Mus nu numai că a fost mai rapidă și mai abundentă, dar a prezentat, de asemenea, un raport mai mare între colagenul de tip I și III (Fig. S9h, h’). Având în vedere producția exuberantă de colagen de tip I în Mus, ne-am întrebat dacă fibroblastele rezidente se diferențiază în miofibroblaste, care contribuie la cicatrizare în loc de regenerare (analizat în28). Folosind alfa actină musculară netedă (αSMA), am găsit miofibroblaste în abundență ridicată în tot țesutul urechii la Mus, în timp ce acestea erau aproape complet absente în urechile Acomys (Fig. 4m, n). Aceste date coroborează importanța ECM din rană pentru a promova proliferarea în timp ce antagonizează diferențierea și susțin lucrările anterioare care arată că formarea precoce a colagenului de tip I antagonizează regenerarea apendicelui27.

Datele noastre sugerează că regenerarea reparatorie a urechii la Acomys este un echilibru între reformarea prematură a dermului (cicatrizare) și menținerea proliferării celulare într-un mediu pro-regenerator. În schimb, Mus nu reușește să formeze (sau să mențină) o epidermă a rănilor, ceea ce coincide cu formarea precoce a membranei bazale și stratificarea epidermei. Acest lucru duce la pierderea proliferării celulare, la creșterea depunerii de colagen de tip I (în locul colagenului de tip III), la activarea miofibroblastelor și, în cele din urmă, la formarea de cicatrici. În timp ce datele noastre sugerează că regenerarea urechii împărtășește caracteristici similare cu formarea blastemelor, înțelegerea semnalelor moleculare necesare pentru a organiza și menține o epidermă rănită și pentru a identifica descendența celulelor care se regenerează este crucială pentru a aborda modul în care are loc regenerarea la aceste animale. Lucrările viitoare de investigare a modului în care Acomys sunt capabile să controleze fibroza vor arunca lumină asupra modului în care regenerarea și cicatrizarea pot fi echilibrate în fața infecției și inflamației la mamiferele sălbatice și oferă un sistem model ideal pentru a examina regenerarea epimorfă la mamifere.

.