GFP
Proteina fluorescentă verde (GFP) este un produs genetic polipeptidic unic de 238 de aminoacizi descoperit la meduza Aequorea victoria. Proteina are o fluorescență naturală de culoare verde în condiții de iluminare specifice. Proteina își derivă bioluminescența din ciclizarea Ser-Tyr-Gly în cadrul secvenței sale primare de aminoacizi. GFP este destul de stabilă și rezistă la o serie de tratamente și proceduri chimice.1 Prima demonstrație a faptului că această proteină fluorescentă poate fi exprimată într-un sistem heterolog a fost la C. elegans.2 De atunci, GFP a devenit o genă reporter de elecție, deoarece nu necesită transformare biochimică, agent de contrast sau utilizarea de radiații ionizante dăunătoare pentru a fi vizualizată.3 De la acel raport inițial, expresia genei reporter GFP a fost raportată la mai multe organisme, inclusiv la șoareci.4 În plus, sub conducerea unui promotor specific, șoarecii transgenici GFP pot exprima proteina fluorescentă într-un mod specific țesutului și chiar celulei. Vizualizarea neinvazivă este cheia pentru a putea monitoriza procesele fiziologice și biochimice in vivo și în timp real.5
Există numeroase modalități de vizualizare a bioluminescenței GFP. O modalitate de detectare a fluorescenței este cu ajutorul unei lumini UV portabile (365 nM). Există mai multe modele oferite de Fisher la un preț cuprins între aproximativ 100 și 200 de dolari. Metoda luminii UV portabile nu funcționează foarte bine în cazul tulpinii transgenice GFPX (stoc 003116). Dr. Andras Nagy, cercetător donator al tulpinilor transgenice GFPX și GFPU (Stock 003115 și 003116), descrie o cască de vizionare și un filtru adaptabil la microscop care sunt acum disponibile în comerț.
CFP și YFP
Progresele recente au îmbunătățit caracteristicile și utilitatea GFP ca genă reporter. GFP îmbunătățită (EGFP) a fost modificată pentru a fi exprimată la niveluri mai ridicate în celulele mamiferelor și pentru a avea o fluorescență mai intensă. Cyan Fluorescent Protein (CFP) și Yellow Fluorescent Protein (YFP) sunt variante spectrale ale GFP care permit marcarea simultană a mai multor tipuri de celule.
Cubitt AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gross LA, Tsien RY. 1995. Înțelegerea, îmbunătățirea și utilizarea proteinelor verzi fluorescente. Trends Biochem Sci 20:448-55.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. 1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263:802-5.
Hoffman RM. 2002. Imagistica cu proteină fluorescentă verde a celulelor tumorale la șoareci. Lab Animal 31(4): 34-41.
Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. 1997. ‘Șoarecii verzi’ ca sursă de celule verzi omniprezente. FEBS Lett 407:313-9.
Yang M, Baranov E, Jiang P, Sun FX, Li XM, Li L, Hasegawa S, Bouvet M, Al-Tuwaijri M, Chishima T, Shimada H, Moossa AR, Penman S, Hoffman RM. 2000. Imagistica optică a întregului corp a tumorilor și metastazelor care exprimă proteina fluorescentă verde. Proc Natl Acad Sci USA 97:1206-11.
lacZ
Utilizarea unei gene reporter poate permite examinarea modelelor spațiale ale expresiei genei unui anumit promotor în cadrul unui țesut, embrion sau șoarece adult.1 Gena lacZ din E. coli, atunci când este integrată în genomul șoricelului prin tehnici transgenice, poate fi utilizată ca o genă reporter sub controlul unui anumit promotor/înălțător într-o casetă de expresie transgene. Gena lacZ codifică beta-galactosidază, care catalizează scindarea lactozei pentru a forma galactoză și glucoză. Activitatea beta-galactosidazei poate fi identificată atât prin tehnici in situ, cât și in vitro, atunci când este incubată cu substratul beta-galactosidazei, X-gal. Beta-galactosidazei scindează X-gal, un substrat cromogenic, rezultând un colorant albastru insolubil, permițând astfel identificarea celulelor cu activitate lacZ.2 Animalele transgenice pot fi apoi folosite pentru a identifica factorii și condițiile care modulează profilul de expresie al promotorului sau amplificatorului.
.