Inginerie metabolică a Escherichia coli pentru producerea de cinamaldehidă

Selecția enzimelor pentru biosinteza cinamaldehidei

Cinnamaldehida poate fi sintetizată din l-fenilalanină, iar biosinteza sa necesită trei reacții enzimatice: (i) deaminare a l-fenilalaninei în acid cinamic de către fenilalanină-amoniac liază (PAL, EC 4.3.1.24), (ii) ligarea acid-țiol a acidului cinamic la cinnamil-CoA de către 4-cumarat:CoA ligază (4CL, EC 6.2.2.1.12), și (iii) reducerea cinnamil-CoA la cinnamaldehidă de către cinnamil-CoA reductaza (CCR, EC 1.2.1.44) (Fig. 1a) . PAL este o enzimă omniprezentă care poate fi găsită în multe plante, ciuperci și unele bacterii și care are diverse activități și specificități în funcție de originea enzimei . Am examinat două enzime PAL, una din planta Arabidopsis thaliana (AtPAL) și alta din bacteria Streptomyces maritimus (SmPAL), pentru a stabili dacă sunt adecvate pentru producerea acidului cinamic în E. coli. În cazul AtPAL, există patru izomeri, inclusiv de la AtPAL1 la AtPAL4, și s-a raportat anterior că majoritatea dintre ei (AtPAL1, 2 și 4) au activități la fel de mari decât cea a AtPAL3 la l-fenilalanina ca substrat, astfel încât am selectat AtPAL1 ca reprezentant din sursa vegetală. Constantele lor cinetice (Km) au fost raportate ca fiind de 68 și, respectiv, 23 μM . Fiecare enzimă PAL cu marcaj His a fost produsă în E. coli BL21(DE3) și purificată conform procedurilor descrise în „Metode”. Ambele enzime, AtPAL1 (78 kDa) și SmPAL (56 kDa), au fost purificate cu succes (Fișier suplimentar 1: Figura S1). Deși nivelul de expresie al AtPAL1 nu a fost atât de ridicat încât banda nu a putut fi observată în benzile 1 și 2 din SDS-PAGE, banda de AtPAL1 a putut fi clar observată după cromatografia pe coloană de afinitate în banda 3 în care a fost încărcat eluatul concentrat. Molaritatea echivalentă a fiecărei enzime PAL purificate a fost incubată cu aceeași cantitate de l-fenilalanină (ca substrat), iar titrul de producere a acidului cinamic a fost cuantificat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) (Fișier suplimentar 2: Figura S2). După cum se arată în Fig. 1b, SmPAL a prezentat o activitate semnificativ mai mare (de 21 de ori la reacția la 30 °C și de 27 de ori la reacția la 37 °C) decât cele ale AtPAL1.

Am examinat, de asemenea, două enzime 4CL diferite, una de la Streptomyces coelicolor (ScCCL) și alta de la A. thaliana (At4CL), pentru a determina dacă sunt potrivite pentru a transforma acidul cinamic în cinnamaldehidă în E. coli. În cazul At4CL, se știe că există 14 izoforme putative (At4CL1-At4CL14). Dintre cele 14 izoforme, At4CL1-3 au activități similare cu cinamatul, în timp ce restul izoformelor nu au . Prin urmare, am selectat At4CL1 ca reprezentant. De asemenea, am utilizat enzima CCR de la A. thaliana (AtCCR1) pentru conversia cinnamamil-CoA în cinnamaldehidă . Fiecare enzimă 4CL (At4CL1 și ScCCL ) a fost testată în combinație cu enzima CCR din A. thaliana (AtCCR). Toate enzimele au fost purificate cu succes cu o puritate ridicată (Fișier suplimentar 1: Figura S1). Pentru a compara activitățile enzimatice ale At4CL1 și ScCCL, au fost pregătite două reacții, (i) At4CL1 cu AtCCR și (ii) ScCCL cu AtCCR, care au fost amestecate cu acid cinamic ca substrat. După incubare la 30 și 37 °C, titrul de cinamaldehidă a fost analizat prin HPLC. După cum se arată în Fig. 1c, combinația dintre ScCCL și AtCCR a dus la un titru de producție mai mare de cinamaldehidă (de 4,4 ori la reacția la 30 °C și de 10,4 ori la reacția la 37 °C) decât combinația dintre At4CL1 și AtCCR. Pe baza acestor rezultate, am construit un sistem de biosinteză a cinamaldehidei în E. coli, așa cum este descris mai jos, folosind următoarele enzime: SmPAL, ScCCL și AtCCR.

Construcția căii de biosinteză a cinamaldehidei în E. coli

Pentru a produce cinamaldehidă în E. coli, genele SmPAL, ScCCL și AtCCR au fost clonate în pTrc99A în următoarea ordine: SmPAL, ScCCL și AtCCR: SmPAL, ScCCL și AtCCR (obținându-se pHB-CAD) (Fig. 2a). E. coli W3110 care adăpostește pHB-CAD a fost cultivat la două temperaturi diferite (30 și 37 °C) pentru a găsi temperatura optimă pentru producerea de cinamaldehidă. Expresia enzimelor a fost analizată prin SDS-PAGE, urmată de analiza western blot, așa cum este descris în „Metode”. La ambele temperaturi, toate enzimele au fost exprimate bine și foarte solubile (Fig. 2b). Deși fiecare enzimă a fost exprimată la un nivel diferit, expresia fiecărei enzime a fost marginal mai bună la 37 °C decât la 30 °C. De asemenea, analiza titlului de cinamaldehidă produsă în mediul de cultură cu ajutorul HPLC a arătat că titlul de producție de cinamaldehidă a fost de 4,5 ori mai mare la 37 °C decât la 30 °C (Fig. 2c). Am presupus că titrul de producție mai mare de cinamaldehidă la 37 °C a fost cauzat de creșterea nivelului de expresie a tuturor enzimelor biosintetice la 37 °C în mod activ, chiar dacă aceste enzime sunt active la 30 °C . În continuare, toate culturile pentru producția de cinamaldehidă au fost efectuate la 37 °C.

Inginerie de tulpină pentru creșterea rezervei intracelulare de l-fenilalanină

Pentru biosinteza cinamaldehidei, l-fenilalanina este necesară ca precursor esențial . Prin urmare, pentru a spori producția de cinamaldehidă, este de dorit să se mărească rezerva intracelulară de l-fenilalanină. În acest scop, am reproiectat în mod rațional E. coli pentru a produce mai multă l-fenilalanină. Folosind ca ghid informațiile metabolice și de reglementare disponibile, am modificat E. coli W3110 după cum urmează: (i) ștergerea genei crr care codifică proteina EIIAGlc legată de sistemul fosfoenolpiruvat fosfotransferazei specifice glucozei (PTS) pentru moderarea ratei de absorbție a substratului, diminuarea revărsării de metaboliți și îmbogățirea precursorilor, (ii) ștergerea genei tyrR pentru a atenua reglarea strânsă a regulonului TyrR care conține genele de sinteză a aminoacizilor aromatici (AAA), (iii) ștergerea genelor trpE (componenta antranilat sintetazei) și tyrA pentru a preveni pierderea fluxului de carbon în căile concurente (biosinteza de l-triptofan și l-tirozină) și (iv) ștergerea genei pykA (piruvat kinaza A) pentru a îmbogăți precursorul și a echilibra fluxul între creștere și producția de l-fenilalanină (Fig. 3). Pe baza schemei de mai sus, au fost dezvoltați cinci mutanți knockout secvențiali de E. coli W3110 (YHP01-YHP05) (tabelul 1).

În primul rând, un PTS fosfoenolpiruvat specific glucozei a fost inactivat prin deleția genei crr în E. coli W3110, obținându-se E. coli YHP01. Deși acest lucru întrerupe sistemul principal de internalizare a glucozei, YHP01 poate crește în continuare în medii definite care conțin glucoză ca unică sursă de carbon, deoarece PTS specifică mannozei și galactoza permează pot continua să internalizeze glucoza în citoplasmă. Ocolirea PTS duce la o creștere a rezervei de fosfoenolpiruvat (PEP), care facilitează în cele din urmă sinteza de l-fenilalanină . În continuare, am eliminat gena tyrR în YHP01 pentru a obține tulpina YHP02. Proteina TyrR este un regulator al regulonului TyrR, care conține opt gene implicate în biosinteza de AAA . De asemenea, suprimarea sa poate crește rezerva de l-fenilalanină prin atenuarea reglementării stricte a genelor legate de sinteza AAA. În continuare, am eliminat secvențial genele trpE și tyrA începând cu tulpina YHP02, obținând tulpinile YHP03 și, respectiv, YHP04. În calea de biosinteză a AAA, are loc un punct de ramificare finală în care corismatul poate fi transformat în l-fenilalanină, l-triptofan sau l-tirozină de către enzimele PheA, TrpE sau TyrA, respectiv. Delețiile genelor trpE și TyrA pot împiedica pierderea de carbon în căile concurente de biosinteză a l-triptofanului și l-tirozinei. În cele din urmă, am eliminat gena pykA în YHP04 pentru a obține tulpina YHP05. Gena pykA codifică piruvat kinaza A (PykA), care constituie cea de-a doua etapă consumatoare de PEP. Prin ștergerea genei pykA, mai mult PEP poate fi utilizat în calea shikimatului și, în consecință, se poate produce o cantitate mai mare de l-fenilalanină. În fiecare tulpină (YHP01-YHP05), deleția genelor a fost verificată prin PCR și prin electroforeză pe gel de agaroză (Fișier suplimentar 3: Figura S3).

Toate tulpinile de E. coli modificate, inclusiv YHP01-YHP05 și E. coli parental W3110, au fost cultivate în flacoane cu agitare care conțin medii semi-definite, iar creșterea celulară și producția de l-fenilalanină au fost comparate. După 48 de ore de cultivare, toate tulpinile modificate au crescut puțin mai bine decât tulpina W3110; în special, tulpina E. coli YHP05 a prezentat cea mai mare densitate celulară (Fig. 4a). Un studiu anterior a observat, de asemenea, că inactivarea izozimelor PTS și Pyk a crescut fluxul de carbon pentru formarea biomasei datorită efectului de conservare a unor cantități reduse de metaboliți intermediari rezultați din scăderea absorbției și catabolismului glucozei . Am analizat, de asemenea, titlul de producție de l-fenilalanină în supernatantul de cultură prin HPLC. În cazul tulpinii parentale W3110, titrul de producere a l-fenilalaninei a fost de 0,24 g/L, dar titrul de l-fenilalanină a crescut treptat în cazul tulpinilor de E. coli modificate (Fig. 4a). E. coli YHP05, în care genele crr, tyrR, trpE, tyrA și pykA au fost eliminate, a prezentat cel mai mare titru de producție de l-fenilalanină (0,52 g/L), care a fost de 2,2 ori mai mare decât cel al E. coli parental W3110. Prin urmare, am decis să folosim tulpina E. coli YHP05 pentru continuarea ingineriei.

Sistem de supraexprimare pe bază de plasmide pentru a crește rezerva intracelulară de l-fenilalanină

Începând cu tulpina E. coli YHP05, producția de l-fenilalanină a fost îmbunătățită în continuare prin supraexprimarea genei pe bază de plasmide. Inhibarea feedback-ului în calea de sinteză a l-fenilalaninei de către shikimat și l-fenilalanină a fost redusă prin supraexprimarea izoenzimelor sau prin introducerea de mutații în enzimele implicate în calea shikimatului, după cum urmează: (i) supraexprimarea genei 3-deoxy-d-arabinoheptulosonat 7-fosfat (DAHP) sintetază care este codificată în aroG cu inginerie (AroG8/15), (ii) supraexprimarea genelor ydiB și aroK care codifică shikimat dehidrogenază și shikimat kinază pentru a spori fluxul de carbon în calea shikimatului, (iii) supraexprimarea genei pheA care codifică mutaza CHA/prefenat dehidrataza cu inginerie pentru îmbunătățirea afinității de legare a substratului (PheAfbr, dm) și (iv) supraexprimarea genelor galP (galactoză permează) și glk (glucokinază) pentru a facilita absorbția glucozei (Fișier suplimentar 4: Figura S4).

În primul rând, pentru a atenua inhibiția de reacție, s-a construit plasmidul pTac15kG, care conținea gena aroG8/15 modificată. AroG este principala enzimă implicată în sinteza de DAHP, dar AroG este complet inhibată de l-fenilalanină (până la 0,1 mM) . Se știe că introducerea a două mutații (D146N și A202T) a dus la rezistența la inhibiția de reacție fără a afecta activitatea sa specifică ridicată (AroG8/15) , astfel încât am supraexprimat această enzimă AroG8/15 mutantă. În continuare, au fost construite două plasmide (pTac15kGB și pTac15kGBK) pentru a supraexprima genele ydiB și aroK împreună cu gena aroG8/15, respectiv. Fluxul metabolic către calea shikimatului poate fi îmbunătățit atunci când shikimatul dehidrogenază (YdiB) și shikimatul kinaza (AroK) sunt supraexprimate. De asemenea, a fost construită ulterior plasmidă pTac15kGBKA pentru a supraexprima gena pheA, care codifică corismata mutază/prefenat dehidrataza cu mutații. În această construcție, am amplificat doar primii 300 de aminoacizi ai PheA de tip sălbatic (PheAfbr), care exclude domeniul de reglare; prin urmare, PheAfbr este slab influențată de inhibiția de reacție. În plus, deoarece PheAfbr are o valoare Km mai mare decât PheA de tip sălbatic, reflectând afinitatea sa redusă de legare la substrat , am introdus două mutații (E159A și E232A) în PheAfbr pentru a spori afinitatea sa de legare la substrat, obținând PheAfbr, dm . În cele din urmă, s-a construit plasmidul pYHP pentru a supraexprima suplimentar genele galP și glk, care codifică galactoza permează și, respectiv, glucokinaza. Ambele enzime facilitează absorbția glucozei .

După construirea a cinci plasmide, inclusiv pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBKA, și pYHP (tabelul 1), fiecare plasmidă a fost transformată în E. coli YHP05. După cultivarea timp de 48 de ore în flacoane cu agitare conținând medii semi-definite, s-a analizat creșterea celulară și titrul de producție de l-fenilalanină. Toate celulele au crescut bine și, în special E. coli YHP05 care conține pYHP a crescut la o densitate celulară marginal mai mare (OD600 = 9,76) decât celelalte (figura 4b). Am analizat, de asemenea, titlul de producție de l-fenilalanină în supernatantul culturii prin HPLC. Supraexprimarea genei aroG8/15 (pTac15kG) a dus la o creștere semnificativă a producției de l-fenilalanină (2,25 g/L) în comparație cu YHP05 care nu conținea nicio plasmidă (0,52 g/L) (Fig. 4b). Supraexprimarea ulterioară a altor gene a dus la o creștere în serie a titrului de producție de l-fenilalanină, iar E. coli YHP05 care a găzduit pYHP a prezentat cel mai mare titru de producție de l-fenilalanină (3,91 g/L) (Fig. 4b). Efectul plasmidului pYHP a dus la o creștere semnificativă a producției de l-fenilalanină de 16,4 ori și, respectiv, de 7,5 ori. În cultivarea E. coli YHP05 care adăpostește pYHP, producția de l-fenilalanină pe glucoză și productivitatea au fost de 0,270 g/g și, respectiv, 0,082 g/L/h (Fișier suplimentar 5: Figura S5). Prin urmare, în E. coli YHP05 modificat care adăpostește pYHP, rezerva de l-fenilalanină a fost semnificativ îmbunătățită. Liu et al. au raportat anterior o producție de l-fenilalanină în E. coli de până la 47 g/L . Cu toate acestea, acest record a putut fi atins în cultivarea pe loturi hrănite (la scară de 15 L) și au folosit coexpresia transportorului de l-fenilalanină (YddG) pentru producerea eficientă de l-fenilalanină în mediul de cultură. În lucrarea noastră, nu am introdus YddG, deoarece scopul final al lucrării noastre nu a fost producția de l-fenilalanină, ci producția de cinamaldehidă. Deși titrul de l-fenilalanină obținut în lucrarea noastră nu a fost unul record, am considerat că a fost suficient de ridicat pentru producerea de cinamaldehidă. Prin urmare, am decis să folosim această tulpină modificată pentru producția de cinamaldehidă.

Producția de cinamaldehidă în E. coli modificat

Utilizând E. coli modificat YHP05 care adăpostește pYHP, am examinat mai întâi producția de acid cinamic. Pentru acest experiment, s-a construit plasmidul pHB-CA, care conține gena SmPAL sub promotor trc indus de IPTG (tabelul 1). E. coli YHP05 care adăpostește atât pHB-CA, cât și pYHP a fost cultivat în flacoane timp de 48 de ore și s-a analizat titlul de producție de acid cinamic. E. coli YHP05 și E. coli W3110 care conține pHB-CA (fără pYHP) au fost, de asemenea, examinate ca martori. Tiparele de creștere ale tuturor celulelor au fost similare (Fig. 5a), iar E. coli W3110 și YHP05 care conțin pHB-CA au produs 79 și, respectiv, 108 mg/L de acid cinamic (Fig. 5b). E. coli YHP05 care adăpostește atât pHB-CA, cât și pYHP a prezentat un titru de producție semnificativ îmbunătățit (287 mg/L), care a fost de 3,6 ori și, respectiv, de 2,7 ori mai mare decât cel al E. coli W3110 și YHP05 care adăpostește pHB-CA (Fig. 5b). Din cunoștințele noastre, acest titru de producție a fost, de asemenea, de 1,5 ori mai mare decât cel mai ridicat nivel (186 mg/L) raportat la E. coli . Acest rezultat indică în mod clar că ridicarea cantității de l-fenilalanină în tulpina E. coli modificată contribuie în mod pozitiv la creșterea producției de acid cinamic.

Ca obiectiv principal, am examinat producția de cinamaldehidă în tulpina modificată E. coli YHP05, care a fost transformată cu pHB-CAD și pYHP. De asemenea, au fost examinate ca martori E. coli YHP05 și E. coli W3110 care adăpostesc pHB-CAD (fără pYHP). Creșterea celulelor a fost similară (Fig. 6a), iar cele trei enzime de biosinteză a cinamaldehidei au fost bine exprimate în toate celulele examinate (Fișier suplimentar 6: Figura S6). După cultivarea în flacoane timp de 48 de ore, s-au colectat supernatantele de cultură și titlurile de producție de cinamaldehidă au fost determinate prin HPLC. E. coli W3110 (pHB-CAD) și E. coli YHP05 (pHB-CAD) au prezentat un titru de producere a cinamaldehidei de până la 2,18 și, respectiv, 6,3 mg/L (figura 6b). Dimpotrivă, E. coli YHP05 (pHB-CAD și pYHP) a prezentat un titru de producție semnificativ mai mare (75 mg/L), care a fost de 35 de ori mai mare decât cel al E. coli W3110 (pHB-CAD).

Activitatea nematicidă a cinamaldehidei produse de E. coli modificat

Pentru a evalua activitatea nematicidă a cinamaldehidei produse în mediul de cultură, nematozii B. xylophilus au fost tratați cu cinamaldehidă, urmând procedurile descrise în „Metode” . Supernatantul culturii de E. coli YHP05 care adăpostește pYHP și pHB-CAD a fost diluat până când concentrația finală de cinamaldehidă a fost de 60 mg/L, iar nematodele au fost tratate cu supernatantul de cultură diluat. După 1 și 4 ore, doar 26 % și, respectiv, mai puțin de 18 % dintre nematozi au supraviețuit (Fig. 7). Ca martor pozitiv, nematozii au fost tratați cu cinamaldehidă purificată și disponibilă în comerț, la o concentrație echivalentă (60 mg/L). După 4 h, aproape toți nematozii (95 %) au fost uciși. Aceste rezultate au indicat că activitățile nematicide au fost similare între cinamaldehida cumpărată din comerț și cea produsă în acest studiu. Ca martor negativ, a fost testat, de asemenea, supernatantul culturii de E. coli W3110 și, așa cum era de așteptat, aproape toți nematozii au supraviețuit (>92 %) după 4 h.

.