Rezultate și discuții
Două moduri de scindare a ADN-ului de către R.KpnI în prezența Mg2+.
R.KpnI este o REază extrem de promiscuă în reacțiile catalizate de Mg2+, spre deosebire de majoritatea celorlalte REaze (11, 12). În Fig. 1 A, este prezentat modelul caracteristic de scindare de către R.KpnI într-o gamă de concentrații de Mg2+. La concentrații mai mici ale ionului metalic (50-500 μM), s-a observat doar scindarea secvenței cognate (benzile 2-5). Cu toate acestea, la concentrații de Mg2+ >500 μM, a fost evidentă scindarea promiscuă (benzile 6-9). Modurile specifice și promiscue de scindare de către R.KpnI în funcție de concentrația de Mg2+ au fost confirmate prin analiza scindării oligonucleotidelor. Substratul oligonucleotidic care conținea secvența canonică a fost scindat eficient de R.KpnI chiar și la 20 μM Mg2+. În schimb, secvențele necanonice au fost scindate eficient doar la >500 μM Mg2+ . Aceste rezultate au implicat faptul că R.KpnI prezintă două profiluri diferite de activare a metalelor – unul pentru substraturile ADN canonice și celălalt pentru cele necanonice. Enzima urmează un profil hiperbolic de activare a metalului pentru substratul canonic și un model sigmoidal pentru substratul necanonic (Fig. 1 B). Aceste date au fost supuse analizei graficului Hill (Fig. S2; și a se vedea SI Text ), iar coeficientul Hill pentru legarea ionilor metalici este prezentat în tabelul 1. Analiza Hill plot a evidențiat legarea ionului metalic suplimentar la enzimă și rolul său în scindarea secvențelor necanonice. Astfel, recrutarea unui ion metalic suplimentar în apropierea sau la distanță de situsul activ al enzimei a părut a fi necesară pentru a induce scindarea promiscuă de către enzimă. Dacă acesta este cazul, mutația reziduurilor implicate în coordonarea ionului metalic din al doilea situs ar trebui să elimine activitatea promiscuă, rezultând o enzimă foarte specifică secvenței. Am testat această ipoteză.