Una dintre cele mai importante proceduri în virusologie este măsurarea titrului de virus – concentrația de virusuri într-o probă. O abordare utilizată pe scară largă pentru determinarea cantității de virusuri infecțioase este testul în plăci. Această tehnică a fost dezvoltată pentru prima dată pentru a calcula titrurile stocurilor de bacteriofagi. Renato Dulbecco a modificat această procedură în 1952 pentru a o utiliza în virologia animală și, de atunci, a fost utilizată pentru determinarea fiabilă a titlurilor multor virusuri diferite.
Pentru a efectua un test în plăci, se prepară diluții de 10 ori dintr-un stoc de virus și se inoculează alicote de 0,1 ml pe monocapace de celule sensibile. După o perioadă de incubare, pentru a permite virusului să se atașeze la celule, monostraturile sunt acoperite cu un mediu nutritiv care conține o substanță, de obicei agar, care determină formarea unui gel. Atunci când plăcile sunt incubate, celulele infectate inițial eliberează progeniturile virale. Răspândirea noilor viruși este limitată la celulele vecine de către gel. În consecință, fiecare particulă infecțioasă produce o zonă circulară de celule infectate numită placă. În cele din urmă, placa devine suficient de mare pentru a fi vizibilă cu ochiul liber. Coloranții care colorează celulele vii sunt adesea utilizați pentru a spori contrastul dintre celulele vii și plăci. Numai virușii care provoacă leziuni vizibile ale celulelor pot fi analizați în acest mod. În stânga este prezentat un exemplu de plăci formate de poliovirus pe un monostrat de celule HeLa. În această imagine, celulele au fost colorate cu cristal violet, iar plăcile sunt ușor vizibile acolo unde celulele au fost distruse de infecția virală.
Titrul unui stoc de virus poate fi calculat în unități formatoare de plăci (PFU) pe mililitru. Pentru a determina titrul virusului, se numără plăcile. Pentru a minimiza eroarea, se numără numai plăcile care conțin între 10 și 100 de plăci, în funcție de dimensiunea plăcii de cultură celulară care este utilizată. Principiile statistice dictează că, atunci când sunt numărate 100 de plăci, titrul probei va varia cu plus sau minus 10%. Fiecare diluție este placată în dublu exemplar pentru a spori precizia. În exemplul prezentat mai jos, pe placa realizată din diluția 10-6 sunt 17 plăci. Prin urmare, titrul stocului de virus este de 1,7 x 108 PFU/ml.
În continuare vom analiza modul în care testul pe plăci poate fi folosit pentru a pregăti stocuri virale clonale, o etapă esențială pentru studiul geneticii virale.
Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Unele probleme de virologie animală studiate prin tehnica plăcii. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 18, 273-279
.