DISCUȚII
Citrobacter este o cauză semnificativă de infecții oportuniste; C. diversus este asociat cu aproximativ 40% din cazurile prezentate, în timp ce C. freundiireprezintă aproximativ 29% (11). Citrobacterspp. cauzează meningită neonatală și au o înclinație neobișnuită de a provoca abcese cerebrale (8, 14). Patogenia Citrobacter spp. care provoacă meningită și abces cerebral nu este bine caracterizată; cu toate acestea, ca și în cazul altor bacterii care provoacă meningită, trebuie să aibă loc o penetrare a barierei hematoencefalice. Prezentul studiu a fost realizat pentru a înțelege mai bine interacțiunile potențiale ale lui Citrobacter cu bariera hematoencefalică. C. freundii a fost aleasă ca bacterie model pentru aceste studii deoarece genetica bacteriană este mai bine definită și este disponibilă o bibliotecă genomică pentru eventuale studii privind baza moleculară a invaziei și replicării luiCitrobacter în HBMEC. Experimentele efectuate cu un izolat de lichid cefalorahidian de C. diversus au dat rezultate similare (datele nu sunt prezentate), sugerând că frecvența și mecanismul de invazie în HBMEC pentru aceste două specii ar putea fi asemănătoare.
Bariera hematoencefalică este o structură complexă care constă din epiteliul plexului coroidian și endoteliul capilar cerebral. Prezența joncțiunilor strânse și activitatea pinocitotică scăzută pentru celulele endoteliale are ca rezultat restricționarea macroelementelor care trec prin bariera hemato-encefalică. În acest moment, nu se știe în ce punct al barierei hematoencefalice pătrunde C. freundii, dar s-a constatat că plexul coroidian este rareori implicat în modelul de meningită hematogenă experimentală cu Citrobacter la șobolanii sugari (16). În plus, celulele microvasculare endoteliale acoperă cea mai mare suprafață a barierei hematoencefalice, iar alte bacterii care cauzează meningită au demonstrat că invadează celulele endoteliale microvasculare in vitro (13, 20, 25). Prin urmare, am selectat HBMEC pentru studiul nostru. Testele de invazie în culturi de țesuturi și studiile TEM au furnizat dovezi că C. freundii invadează HBMEC. Rezultatele testelor de invazie efectuate în prezența diferiților inhibitori celulari eucarioți sugerează că invazia lui C. freundii în HBMEC este un proces dependent de microfilamente, microtubuli, sinteza proteinelor de novo și acidificarea endosomului. Testele de invazie prelungită au determinat că C. freundii poate supraviețui și se poate replica intracelular pentru perioade prelungite in vitro. Analizele TEM au arătat că localizarea intracelulară a celulelor individuale și multiple de C. freundii se află în structuri asemănătoare unor vacuole cu membrană unică. Experimentele Transwell au demonstrat că C. freundii poate traversa un monostrat polarizat de HBMEC, în timp ce E. coli neinvazivă nu a putut. Mai mult, datele noastre preliminare arată că C. freundii penetrează bariera hemato-encefalică în modelul neonatal de meningită hematogenă experimentală la șobolani (21). Luate împreună, aceste constatări sugerează că C. freundii invadează vacuolele, posibil se replică, se transcitează prin HBMEC, este eliberat în partea bazolaterală și, astfel, pătrunde în bariera hemato-encefalică.
Au fost raportate cazuri de invazie a celulelor eucariote de către C. freundii (22, 35). Cu toate acestea, acesta este primul raport privind invazia HBMEC de către C. freundii. În mod curios, cerințele eucariote pentru invazia C. freundii sunt la fel de diverse ca și tipurile de celule pe care s-a demonstrat că C. freundii le invadează. De exemplu, s-a demonstrat că inhibitorul MDC al gropilor acoperite cu clatrină inhibă invazia C. freundii în toate celelalte tipuri de celule analizate (de exemplu, celule epiteliale vasculare, intestinale și vezicale umane), cu excepția, așa cum se arată în acest studiu, a HBMEC. În plus, alte bacterii cauzatoare de meningită, caracterizate până în prezent, pătrund în HBMEC pe o cale (sau mai multe căi) care depinde de microtubuli și este sensibilă la MDC (20, 24, 27). S-a demonstrat că inhibitorii de gropi acoperite cu clatrină MDC și ouabaină nu inhibă toți receptorii; astfel, este posibil ca receptorul necesar pentru invazia C. freundii în HBMEC să nu fie afectat de inhibitorul MDC sau ouabaină. Deși dovezile adunate până în prezent sugerează că este posibil ca intrarea C. freundii în HBMEC să nu se producă pe o cale mediată de un receptor sensibil la MDC sau oabain, se pare că sunt necesare atât acidificarea endosomului, cât și sinteza de novo a proteinelor. Datele disponibile sugerează două scenarii posibile. Acidificarea endosomului poate fi necesară ca un declanșator de mediu pentru supraviețuirea bacteriană intracelulară. Cerințe similare au fost caracterizate pentru invazia epitelială a Salmonella (26). Alternativ, este posibil ca acidificarea endosomului și sinteza proteinelor să fie necesare pentru separarea complexului ligand-receptor, sinteza receptorului și/sau prezentarea receptorului la suprafața HBMEC pentru ca invazia lui C. freundii să aibă loc. Acest din urmă scenariu amintește de alți agenți patogeni invazivi, în cazul în care contactul organismului viabil este necesar pentru modularea moleculelor de adeziune a celulelor eucariote care sunt necesare pentru invazie (de exemplu, Streptococcus pneumoniae și receptorul factorului de activare a trombocitelor) (2). Experimentele sunt în curs de desfășurare în laboratorul nostru pentru a face distincția între aceste scenarii propuse.
Sesizările de invazie efectuate în prezența inhibitorilor de microtubuli (atât agenți de depolimerizare, cât și de stabilizare) au scăzut semnificativ capacitatea HBMEC de a prelua C. freundii. Experimentele de microscopie confocală cu anticorpi anti-α-tubulină au arătat că microtubulii se agregă după ce HBMEC intră în contact cu C. freundii. Agregarea microtubulilor a fost un proces dependent de timp; nu s-a observat nicio agregare la 5 minute, s-a observat puțin în 15 minute, iar agregarea clară a fost observată după 30 de minute de incubare a lui C. freundii cu HBMEC. Această agregare a microtubulilor a fost inhibată atunci când celulele au fost tratate fie cu inhibitori de microtubuli, fie cu agenți de inhibare a microfilamentelor. Interesant este faptul că tiparul de colorare a agregării microtubulilor nu s-a colocalizat cu legarea bacteriană, iar zonele din HBMEC care nu au prezentat legare de C. freundii au prezentat, de asemenea, o aglomerare pronunțată de microtubuli. Acest lucru sugerează că contactul bacteriei cu HBMEC poate stimula în mod global agregarea microtubulelor. Rămâne de văzut dacă agregarea microtubulilor este rezultatul unui factor bacterian secretat sau al unui răspuns paracrin la legarea bacteriilor la HBMEC. Mai mult, agregarea microtubulilor ca răspuns la legarea C. freundii poate fi legată de prezentarea postulată a receptorului prin sinteza de novo a proteinelor și acidificarea endosomului. S-a demonstrat anterior că transportul multor receptori către și de la suprafața celulară depinde de microtubuli (10). Prin urmare, o explicație a efectului inhibitor al inhibitorilor de microtubuli asupra intrării lui C. freundii în HBMEC este că agenții pot reduce numărul de receptori HBMEC care mediază invazia lui C. freundii. Experimentele sunt în curs de desfășurare pentru a discerne între aceste posibilități.
Microtubulii s-au dovedit anterior a fi necesari pentru invazia multor agenți patogeni (de exemplu, Neiserria gonorrheae, Haemophilus influenzae, E. coli enteropatogen și enterohemoragic și Campylobacter jejuni (4, 9, 22, 23, 29). Părerea generală a fost că, deși acești agenți patogeni pot pătrunde prin căi dependente de microtubuli, de obicei nu se replică intracelular (6). Datele obținute în acest studiu din testele de invazie extinsă și din analiza TEM sugerează căC. freundii ar putea fi o excepție de la această generalizare. Spre deosebire de ceea ce a fost descris pentru o altă bacterie care se replică în intravacuole, Legionella pneumophila(12), nu a existat nicio apariție a mitocondriilor sau a ribozomilor în imediata apropiere a bacteriei. Acest lucru sugerează că este posibil ca C. freundii să nu utilizeze aceste organite pentru a obține direct energie sau că recrutarea de proteine specifice celulei gazdă nu este necesară pentru supraviețuirea și proliferarea intracelulară (ca în cazul L. pneumophila). De o relevanță deosebită pentru infecțiile sistemului nervos central, s-a demonstrat în mod similar că alte bacterii care provoacă meningită, cum ar fi E. coli K1, GBS și S. pneumoniae, invadează (1, 13, 25) sau invadează și transcitează (20, 27) BMEC; cu toate acestea, nu s-a constatat că aceste organisme se replică în HBMEC. După cum s-a descris mai sus, meningita Citrobacter a fost documentată pentru frecvența sa ridicată de formare a abceselor cerebrale. Rămâne de stabilit dacă replicarea în vacuolele HBMEC este unică pentru Citrobacter și dacă există o corelație cu formarea abceselor.
Citochalasin D inhibă invazia C. freundii în HBMEC; cu toate acestea, folosind imunocolorația, nu am constatat nicio reorganizare detectabilă a microfilamentelor atunci când C. freundii a interacționat cu HBMEC (datele nu sunt prezentate). În plus, pretratarea cu citochalsin D a HBMEC a inhibat agregarea microtubulelor dependentă de bacterie, așa cum a fost vizualizată prin microscopie confocală. Pot exista mai multe explicații pentru aceste rezultate. Efectul citochalsinei D asupra agregării microtubulelor dependente de bacterii se poate datora efectelor indirecte ale inhibitorului de microfilamente asupra rețelei de microtubuli. De exemplu, s-a observat că microtubulii acționează ca structuri de ancorare pentru F-actina (28). Prin urmare, întreruperea rețelei de microfilamente poate afecta rețeaua de microtubuli și, astfel, poate afecta indirect invazia dependentă de microtubuli a C. freundii în HBMEC. Alternativ, o etapă de invazie dependentă de actină poate precede o etapă dependentă de microtubuli în invazia C. freundii în HBMEC. Această etapă inițială poate avea ca rezultat o reorganizare a microfilamentelor atunci când bacteriile sunt inițial în contact cu HBMEC; cu toate acestea, aceste evenimente pot fi tranzitorii, iar modelul experimental care utilizează microscopia de imunofluorescență poate să nu detecteze în mod adecvat apariția lor. O situație similară este observată pentru invazia mediată de Yersiniainvasin (36). Prin urmare, în cazul în care etapele inițiale ale invaziei sunt împiedicate de citochalasin D, etapele ulterioare ale invaziei care depind de microtubuli nu sunt declanșate. S-a demonstrat anterior că actina funcționează în translocarea factorilor proteici de legare a actinei la membrana plasmatică, precum și în semnalizarea citosolică (19). În plus, citochalasina D inhibă intrarea Salmonella prin întreruperea translocării proteinelor de legare a actinei la locul de intrare a bacteriei (7). Este posibil ca, în cazul invaziei de C. freundii în HBMEC, microfilamentele de actină să fie necesare pentru semnalizarea citosolică și/sau pentru penetrarea bacteriei la nivelul membranei plasmatice, iar microtubulii să fie necesari pentru transportul bacteriilor legate de membrană de la membrana plasmatică spre partea bazolaterală (sau chiar mai adânc în interiorul celulei). Astfel, o întrerupere în oricare dintre etapele invaziei ar duce la un „blocaj de trafic.”
În concluzie, rezultatele prezentate aici indică faptul că C. freundii poate invada, se poate multiplica în interiorul și poate transcifra HBMEC in vitro. Determinarea bazei genetice pentru aceste fenotipuri va oferi o perspectivă semnificativă asupra fiziopatologiei Citrobactermeningitei și va ajuta potențial la dezvoltarea unor noi strategii terapeutice și preventive. Mai mult, o analiză moleculară comparativă extinsă a Citrobacter cu alte bacterii care cauzează meningită poate face lumină asupra proprietății unice a Citrobacter de formare a abceselor cerebrale.
.