În jurul anului 1000 î.Hr. un val de imigranți s-a stabilit în valea superioară a Tibrului până la Marea Adriatică, dar și în vecinătatea orașului Assisi. Aceștia erau umbrienii, care trăiau în mici așezări fortificate pe terenuri înalte. Începând cu anul 450 î.Hr. aceste așezări au fost preluate treptat de către etrusci. Romanii au preluat controlul asupra Italiei centrale după bătălia de la Sentinum din 295 î.Hr. Aceștia au construit municipiul înfloritor Asisium pe o serie de terase de pe Monte Subasio. Vestigii romane pot fi încă găsite în Assisi: zidurile orașului, forumul (acum Piazza del Comune), un teatru, un amfiteatru și Templul Minervei (acum transformat în Biserica Santa Maria sopra Minerva). În 1997, au fost descoperite, de asemenea, rămășițele unei vile romane care conținea mai multe camere bine conservate, cu fresce și mozaicuri într-o stare rar întâlnită în afara unor situri precum Pompei.
În 238 d.Hr. Assisi a fost convertit la creștinism de către episcopul Rufino, care a fost martirizat la Costano. Conform tradiției, rămășițele sale se odihnesc în biserica catedrală San Rufino din Assisi.
Ostrogoții regelui Totila au distrus cea mai mare parte a orașului în 545. Assisi a intrat apoi sub stăpânirea longobarzilor, ca parte a Ducatului lombard și apoi franc de Spoleto.
Comuna înfloritoare a devenit o comună ghibelină independentă în secolul al XI-lea. Luptând constant cu guelfii din Perugia, în timpul uneia dintre aceste bătălii, bătălia de la Ponte San Giovanni, Francesco di Bernardone (Sfântul Francisc de Assisi) a fost luat prizonier, punând în mișcare evenimentele care l-au determinat în cele din urmă să trăiască ca un cerșetor, să renunțe la lume și să înființeze Ordinul Fraților Minori.
Orașul, care a rămas în limitele zidurilor romane, a început să se extindă în afara acestor ziduri în secolul al XIII-lea. În această perioadă, orașul se afla sub jurisdicție papală. Rocca Maggiore, fortăreața imperială din vârful dealului de deasupra orașului, care fusese jefuită de popor în 1189, a fost reconstruită în 1367 la ordinul legatului papal, cardinalul Gil de Albornoz.
La început, Assisi a căzut sub stăpânirea orașului Perugia și mai târziu sub mai mulți despoți, cum ar fi soldatul de avere Biordo Michelotti, Gian Galeazzo Visconti și succesorul său Francesco I Sforza, duci de Milano, Jacopo Piccinino și Federico al II-lea da Montefeltro, domnul de Urbino. Orașul a intrat într-un declin profund din cauza ciumei de Moartea Neagră din 1348.
Orașul a intrat din nou sub jurisdicție papală sub domnia Papei Pius al II-lea (1458-1464).
În 1569 a început construcția Bazilicii Santa Maria degli Angeli. În timpul Renașterii și în secolele următoare, orașul a continuat să se dezvolte în mod pașnic, după cum atestă palatele din secolul al XVII-lea ale familiei Bernabei și Giacobetti.
Acum loc al multor pelerinaje, Assisi este legat în legendă de fiul său nativ, Sfântul Francisc. Blândul sfânt a fondat ordinul franciscanilor și împarte onorurile cu Sfânta Ecaterina din Siena ca sfânt patron al Italiei. Mulți, chiar și necreștini, își amintesc de el ca fiind un iubitor al naturii (predicile sale în fața unui auditoriu format din păsări reprezintă una dintre legendele vieții sale).
Assisi a fost lovită de două cutremure devastatoare, care au zguduit Umbria în septembrie 1997. Dar recuperarea și restaurarea au fost remarcabile, deși mai sunt multe de făcut. Pagube masive au fost provocate multor situri istorice, dar principala atracție, Basilica di San Francesco, a fost redeschisă mai puțin de 2 ani mai târziu.
.