Înapoi la noțiuni de bază – Ce este o imunoanaliză – Versiune PDF descărcabilă
Ce este o imunoanaliză sau ELISA?
Imunoanalizele sunt teste rapide și precise care pot fi utilizate la fața locului și în laborator pentru a detecta molecule specifice. Imunoanalizele se bazează pe capacitatea inerentă a unui anticorp de a se lega de structura specifică a unei molecule. Anticorpii sunt proteine generate de animale ca răspuns la invazia unei molecule străine (antigen) în organism. Anticorpii se găsesc în sânge și în fluidele tisulare și se vor lega de antigen ori de câte ori acesta este întâlnit. Deoarece anticorpii sunt dezvoltați în funcție de structura tridimensională specifică a unui antigen, sau a unui analit, aceștia sunt foarte specifici și se vor lega numai de structura respectivă. Odată purificați din sânge, anticorpii monoclonali și policlonali sunt reactivi de analiză ideali pentru detectarea și monitorizarea moleculelor țintă specifice, cu interferențe limitate de la alte substanțe. Patru formate ELISA tipice sunt: imunoanalize sandwich cu anticorpi, imunoanalize antigen-down, teste de inhibiție competitivă și teste rapide.
Antibody Sandwich Immunoassay
Într-o imunoanaliză sandwich cu anticorpi tipică, un anticorp monoclonal este adsorbit pe o placă de microtitrare din plastic. Atunci când proba de testare este adăugată pe placă, anticorpul de pe placă se va lega de antigenul țintă din probă și îl va reține în placă. Atunci când se adaugă un anticorp policlonal în etapa următoare, acesta se leagă, de asemenea, de antigenul țintă (deja legat de anticorpul monoclonal de pe placă), formând astfel un „sandwich” de antigen între cei doi anticorpi diferiți.
– Etapa 1: Anticorpii monoclonali sunt adsorbiți pe godeul unei plăci de microtitrare din plastic cu tampon de acoperire (fără adaos de probă).
– Etapa 2: Adăugarea unei probe (cum ar fi sângele uman, diluat corespunzător) în godeul plăcii de microtitrare. Antigenul țintă se leagă de anticorpul adsorbit pe placă, reținând antigenul în gode.
– Etapa 3: Legarea unui anticorp policlonal conjugat cu enzima la antigenul țintă (legat de anticorpul monoclonal de pe placă), formând astfel un „sandwich” de antigen între cei doi anticorpi diferiți.
– Etapa 4: Adăugarea unui substrat colorimetric pentru detectarea anticorpilor policlonali conjugați cu enzima va genera un semnal de culoare proporțional cu cantitatea de antigen țintă prezentă în proba originală adăugată pe placă.
Antigen-Down (test de imunitate) Imunoanaliză
Într-o imunoanaliză antigen-down (test de imunitate), analitul este acoperit utilizat pentru a lega anticorpii care se găsesc într-o probă. Atunci când se adaugă proba (cum ar fi serul uman), antigenul de pe placă este legat de anticorpii (IgE, de exemplu) din probă, care sunt apoi reținuți în gode. Se adaugă apoi un anticorp specific speciei (anti IgE uman, de exemplu) marcat cu HRP, care se leagă de anticorpul legat de antigenul de pe placă. Cu cât semnalul este mai mare, cu atât mai mulți anticorpi sunt prezenți în probă. Testele Antigen-down (test de imunitate) pot fi configurate ca teste rapide și sunt adesea folosite pentru a diagnostica stările de alergie – în mod obișnuit, sângele unui pacient este testat în raport cu diferiți alergeni pentru a vedea dacă persoana are anticorpi împotriva alergenului respectiv.
Imunoanaliză de inhibiție competitivă
În plus față de formatul sandviș cu anticorpi monoclonali-policlonali (Mo-Po), multe imunoanalize sunt structurate într-un format de inhibiție competitivă. Testele de inhibiție competitivă sunt adesea utilizate pentru a măsura analiții mici, deoarece testele de inhibiție competitivă necesită doar legarea unui singur anticorp, și nu a doi, ca în cazul formatelor ELISA standard. Din cauza probabilității ridicate de apariție a obstacolului steric atunci când doi anticorpi încearcă să se lege de o moleculă mică în același timp, este posibil ca formatul de testare sandwich să nu fie fezabil. Prin urmare, un test de inhibiție competitivă ar fi preferabil.
Într-un test de inhibiție competitivă secvențială, proba și analitul conjugat sunt adăugate în etape, ca într-un test sandwich, în timp ce într-un test de inhibiție competitivă clasic, acești reactivi sunt incubați împreună în același timp. În formatul unui test de inhibiție competitivă secvențială, un anticorp monoclonal este acoperit pe o placă de microtitrare cu 96 de godeuri. Atunci când se adaugă proba, MoAb-ul captează analitul liber din probă. În etapa următoare, se adaugă o cantitate cunoscută de analit marcat fie cu biotină, fie cu HRP. Analitul marcat va încerca, de asemenea, să se lege de MoAb adsorbit pe placă, însă analitul marcat este împiedicat să se lege de MoAb de prezența analitului legat anterior din probă. Acest lucru înseamnă că analitul marcat nu va fi legat de monoclonalul de pe placă dacă monoclonalul a legat deja analitul neetichetat din eșantion. Cantitatea de analit neetichetat din probă este invers proporțională cu semnalul generat de analitul marcat. Cu cât semnalul este mai mic, cu atât este mai mult analit neetichetat în probă. Se poate construi o curbă standard utilizând diluții în serie ale unui standard de analit neetichetat. Valorile eșantioanelor ulterioare pot fi apoi citite din curba standard, așa cum se procedează în cazul formatelor ELISA sandwich. Formatul clasic al testului de inhibiție competitivă necesită adăugarea simultană de analit marcat (analit conjugat) și de analit nelicat (din eșantion). Atât analitul marcat, cât și cel nelansat concurează apoi simultan pentru situsul de legare de pe anticorpul monoclonal de captare de pe placă. Ca și în cazul formatului de inhibiție competitivă secvențială, semnalul colorat este invers proporțional cu concentrația de analit țintă nelansat din probă. Detectarea analitului marcat se poate face prin utilizarea unui substrat de peroxidază, cum ar fi TMB, care poate fi citit pe un cititor de plăci de microtitrare.
Imunoanaliză rapidă
În plus față de plăcile de microtitrare, imunoanalizele sunt, de asemenea, configurate ca teste rapide, cum ar fi un test de sarcină la domiciliu. La fel ca și testele pe plăci de microtitrare, testele rapide utilizează anticorpi pentru a reacționa cu antigene și pot fi dezvoltate ca formate sandwich MoAb-PoAb, formate de inhibiție competitivă și formate antigen-down. În cazul unui test rapid, reactivii anticorpi și antigeni sunt legați de membrane poroase, care reacționează cu probele pozitive, în timp ce canalizează excesul de fluide către o parte nereactivă a membranei. Imunoanalizele rapide vin de obicei în 2 configurații: un test cu flux lateral în care proba este pur și simplu plasată într-un puț, iar rezultatele sunt citite imediat; și un sistem cu flux continuu, care necesită plasarea probei într-un puț, spălarea puțului și, în cele din urmă, adăugarea unui conjugat analitic de aur coloidal, iar rezultatul este citit după câteva minute. Se testează o probă pe bandă sau casetă. Deoarece testele rapide sunt mai rapide decât testele pe placă de microtitrare, necesită o prelucrare redusă a probei, sunt adesea mai ieftine și generează răspunsuri de tip da/nu fără a utiliza un instrument, acestea sunt adesea utilizate pe teren de către persoanele care nu lucrează în laborator și care testează probe întregi. Cu toate acestea, imunoanalizele rapide nu sunt la fel de sensibile și nici nu pot fi utilizate pentru a cuantifica cu exactitate un analit (automonitorizarea nivelului de glucoză din sânge de către diabetici este considerată testare rapidă cantitativă, însă tehnologia imunoenzimatică nu este utilizată pentru aceste teste). Toate testele rapide de imunoanaliză pot fi convertite într-un test pe placă de microtitrare, dar nu toate testele pe placă de microtitrare pot fi convertite într-un test rapid.
.