GFP
Zielone białko fluorescencyjne (GFP) jest produktem genu pojedynczego polipeptydu o długości 238 aminokwasów, odkrytym u meduzy Aequorea victoria. Białko to wykazuje naturalną zieloną fluorescencję w określonych warunkach oświetleniowych. Białko czerpie swoją bioluminescencję z cyklizacji Ser-Tyr-Gly w obrębie swojej pierwotnej sekwencji aminokwasowej. GFP jest dość stabilne i wytrzymuje wiele zabiegów chemicznych i procedur.1 Po raz pierwszy wykazano, że to białko fluorescencyjne może ulegać ekspresji w heterologicznym systemie u C. elegans.2 GFP stało się od tego czasu genem reporterowym z wyboru, ponieważ nie wymaga transformacji biochemicznej, środka kontrastowego ani użycia szkodliwego promieniowania jonizującego w celu wizualizacji.3 Od czasu tego pierwszego doniesienia ekspresję genu reporterowego GFP stwierdzono u wielu organizmów, w tym u myszy.4 Ponadto, pod kierunkiem specyficznego promotora, transgeniczne myszy GFP mogą wyrażać białko fluorescencyjne w sposób specyficzny dla danej tkanki, a nawet komórki. Nieinwazyjna wizualizacja jest kluczem do możliwości monitorowania procesów fizjologicznych i biochemicznych in vivo i w czasie rzeczywistym.5
Istnieją liczne sposoby wizualizacji bioluminescencji GFP. Jednym ze sposobów wykrywania fluorescencji jest ręczna lampa UV (365 nM). Istnieje kilka modeli oferowanych przez firmę Fisher w przedziale cenowym od około 100 do 200 dolarów. Metoda z ręcznym oświetleniem UV nie działa zbyt dobrze dla szczepu transgenicznego GFPX (Stock 003116). Dr. Andras Nagy, donator szczepów transgenicznych GFPX i GFPU (Stock 003115 i 003116), opisuje zestaw słuchawkowy do przeglądania i filtr do adaptacji mikroskopu, które są obecnie dostępne w handlu.
CFP i YFP
Ostatnie postępy poprawiły charakterystykę i użyteczność GFP jako genu reporterowego. Wzmocniony GFP (EGFP) został zaprojektowany tak, aby ulegał ekspresji na wyższych poziomach w komórkach ssaków i intensywniej fluoryzował. Cyan Fluorescent Protein (CFP) i Yellow Fluorescent Protein (YFP) są spektralnymi wariantami GFP, które pozwalają na jednoczesne znakowanie wielu typów komórek.
Cubitt AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gross LA, Tsien RY. 1995. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem Sci 20:448-55.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. 1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263:802-5.
Hoffman RM. 2002. Green fluorescent protein imaging of tumor cells in mice. Lab Animal 31(4): 34-41.
Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. 1997. 'Green mice’ as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett 407:313-9.
Yang M, Baranov E, Jiang P, Sun FX, Li XM, Li L, Hasegawa S, Bouvet M, Al-Tuwaijri M, Chishima T, Shimada H, Moossa AR, Penman S, Hoffman RM. 2000. Whole-body optical imaging of green fluorescent protein-expressing tumors and metastases. Proc Natl Acad Sci USA 97:1206-11.
lacZ
Użycie genu reporterowego może pozwolić na zbadanie przestrzennych wzorców ekspresji genu określonego promotora w obrębie tkanki, zarodka lub dorosłej myszy.1 Gen E. coli lacZ, po zintegrowaniu z genomem myszy za pomocą technik transgenicznych, może być użyty jako gen reporterowy pod kontrolą danego promotora/wzmacniacza w kasecie ekspresji transgenu. Gen lacZ koduje beta-galaktozydazę, która katalizuje rozszczepienie laktozy do postaci galaktozy i glukozy. Aktywność beta-galaktozydazy można zidentyfikować zarówno technikami in situ jak i in vitro, gdy jest ona inkubowana z substratem beta-galaktozydazy X-gal. Beta-galaktozydaza rozszczepia X-gal, substrat chromogenny, w wyniku czego powstaje nierozpuszczalny niebieski barwnik, co pozwala na identyfikację komórek z aktywnością lacZ.2 Transgeniczne zwierzęta mogą być następnie wykorzystane do identyfikacji czynników i warunków, które modulują profil ekspresji promotora lub enhancera.
.