Powrót do podstaw – Co to jest test immunologiczny – wersja PDF do pobrania
Co to jest test immunologiczny lub ELISA?
Atesty immunologiczne są szybkimi i dokładnymi testami, które mogą być stosowane na miejscu i w laboratorium do wykrywania określonych cząsteczek. Testy immunologiczne opierają się na nieodłącznej zdolności przeciwciał do wiązania się z określoną strukturą cząsteczki. Przeciwciała są białkami wytwarzanymi przez zwierzęta w odpowiedzi na inwazję obcej cząsteczki (antygenu) do organizmu. Przeciwciała znajdują się we krwi i płynach tkankowych i wiążą się z antygenem, gdy tylko zostanie on napotkany. Ponieważ przeciwciała są opracowywane do specyficznej trójwymiarowej struktury antygenu lub analitu, są one wysoce specyficzne i będą wiązać się tylko z tą strukturą. Po oczyszczeniu z krwi, przeciwciała monoklonalne i poliklonalne są idealnymi odczynnikami testowymi do wykrywania i monitorowania określonych cząsteczek docelowych z ograniczonymi zakłóceniami ze strony innych substancji. Cztery typowe formaty testów ELISA to: testy immunologiczne typu Sandwich z przeciwciałami, testy immunologiczne typu antygen-dół, konkurencyjne testy hamowania i szybkie testy.
Antibody Sandwich Immunoassay
W typowym teście immunologicznym typu Sandwich z przeciwciałami, przeciwciało monoklonalne jest adsorbowane na plastikowej płytce mikrotitracyjnej. Kiedy do płytki dodawana jest badana próbka, przeciwciało na płytce wiąże docelowy antygen z próbki i zatrzymuje go na płytce. Kiedy w następnym kroku dodawane jest przeciwciało poliklonalne, ono również wiąże się z docelowym antygenem (już związanym z przeciwciałem monoklonalnym na płytce), tworząc w ten sposób antygenową „kanapkę” pomiędzy dwoma różnymi przeciwciałami.
– Etap 1: Przeciwciała monoklonalne są adsorbowane na studzience plastikowej płytki mikrotitracyjnej z buforem powlekającym (bez dodawania próbki).
– Etap 2: Dodanie próbki (takiej jak ludzka krew, odpowiednio rozcieńczonej) do studzienki płytki mikrotitracyjnej. Docelowy antygen wiąże się z przeciwciałem zaadsorbowanym na płytce, zatrzymując antygen w studzience.
– Etap 3: Związanie sprzężonego z enzymem przeciwciała poliklonalnego z docelowym antygenem (związanym z przeciwciałem monoklonalnym na płytce), tworząc w ten sposób antygenową „kanapkę” pomiędzy dwoma różnymi przeciwciałami.
– Krok 4: Dodanie substratu kolorymetrycznego do wykrywania przeciwciał poliklonalnych sprzężonych z enzymem wygeneruje sygnał kolorystyczny proporcjonalny do ilości docelowego antygenu obecnego w oryginalnej próbce dodanej do płytki.
Antygen-Down (test odporności) Immunoassay
W teście immunologicznym antygen-down (test odporności), analit jest pokryty powłoką używaną do wiązania przeciwciał znajdujących się w próbce. Po dodaniu próbki (takiej jak surowica ludzka), antygen na płytce jest wiązany przez przeciwciała (na przykład IgE) z próbki, które są następnie zatrzymywane w studzience. Następnie dodawane jest przeciwciało specyficzne dla danego gatunku (na przykład anty-ludzkie IgE) znakowane HRP, które wiąże się z przeciwciałem związanym z antygenem na płytce. Im wyższy sygnał, tym więcej przeciwciał znajduje się w próbce. Testy typu Antigen-down (test odporności) mogą być skonfigurowane jako szybkie testy i są często stosowane do diagnozowania stanów alergicznych – rutynowo krew pacjenta jest badana przeciwko różnym alergenom, aby sprawdzić, czy dana osoba ma przeciwciała przeciwko temu alergenowi.
Competitive Inhibition Immunoassay
Oprócz formatu Monoclonal-Polyclonal (Mo-Po) Antibody Sandwich, wiele testów immunologicznych ma strukturę konkurencyjnej inhibicji. Testy z inhibicją kompetycyjną są często stosowane do pomiaru małych analitów, ponieważ testy z inhibicją kompetycyjną wymagają wiązania tylko jednego przeciwciała, a nie dwóch, jak w standardowych formatach ELISA. Ze względu na wysokie prawdopodobieństwo przeszkody sterycznej występującej, gdy dwa przeciwciała próbują wiązać się z małą cząsteczką w tym samym czasie, format testu kanapkowego może być niewykonalny. Dlatego preferowane jest badanie inhibicji kompetycyjnej.
W sekwencyjnym badaniu inhibicji kompetycyjnej, próbka i sprzężony analit są dodawane stopniowo, jak w badaniu typu sandwich, podczas gdy w klasycznym badaniu inhibicji kompetycyjnej, odczynniki te są inkubowane razem w tym samym czasie. W formacie testu sekwencyjnej inhibicji kompetycyjnej, przeciwciało monoklonalne jest powlekane na 96-dołkowej płytce mikrotitracyjnej. Kiedy dodawana jest próbka, MoAb wychwytuje wolny analit z próbki. W następnym kroku dodawana jest znana ilość analitu znakowanego biotyną lub HRP. Znakowany analit będzie wtedy również próbował związać się z MoAb zaadsorbowanym na płytce, jednakże znakowany analit jest hamowany przed wiązaniem się z MoAb przez obecność uprzednio związanego analitu z próbki. Oznacza to, że znakowany analit nie zostanie związany przez monoklonalny na płytce, jeżeli monoklonalny już związał nieznakowany analit z próbki. Ilość nieznakowanego analitu w próbce jest odwrotnie proporcjonalna do sygnału generowanego przez znakowany analit. Im niższy sygnał, tym więcej nieznakowanego analitu znajduje się w próbce. Krzywą wzorcową można skonstruować przy użyciu seryjnych rozcieńczeń wzorca nieznakowanego analitu. Kolejne wartości próbki można następnie odczytać z krzywej wzorcowej, tak jak to się robi w formatach ELISA kanapkowego. Klasyczny format analizy inhibicji kompetycyjnej wymaga jednoczesnego dodania znakowanego (sprzężonego analitu) i nieznakowanego analitu (z próbki). Zarówno znakowany, jak i nieznakowany analit konkurują jednocześnie o miejsce wiązania na monoklonalnym przeciwciała wychwytującym na płytce. Podobnie jak w formacie sekwencyjnej inhibicji kompetycyjnej, zabarwiony sygnał jest odwrotnie proporcjonalny do stężenia nieznakowanego analitu docelowego w próbce. Wykrywanie znakowanego analitu może być wykonane przez zastosowanie substratu peroksydazy, takiego jak TMB, który można odczytać na czytniku płytek mikrotitracyjnych.
Szybki test immunologiczny
Oprócz płytek mikrotitracyjnych, testy immunologiczne są również skonfigurowane jako szybkie testy, takie jak domowy test ciążowy. Podobnie jak testy na płytkach mikrotitracyjnych, szybkie testy wykorzystują przeciwciała do reakcji z antygenami i mogą być opracowywane jako formaty kanapkowe MoAb-PoAb, formaty inhibicji kompetycyjnej oraz formaty antygen-down. W przypadku szybkich testów przeciwciała i odczynniki antygenowe są związane z porowatymi membranami, które reagują z próbkami dodatnimi, jednocześnie odprowadzając nadmiar płynów do niereaktywnej części membrany. Szybkie testy immunologiczne są zwykle dostępne w 2 konfiguracjach: test przepływu bocznego, w którym próbka jest po prostu umieszczana w komorze, a wyniki są odczytywane natychmiast; oraz system przepływowy, który wymaga umieszczenia próbki w komorze, przepłukania komory, a następnie dodania koniugatu złota analitowego, a wynik jest odczytywany po kilku minutach. Na jeden pasek lub kasetę testowana jest jedna próbka. Ponieważ szybkie testy są szybsze niż testy na płytkach mikrotitracyjnych, wymagają niewielkiego przetwarzania próbki, są często tańsze i generują odpowiedzi tak/nie bez użycia urządzenia, są często używane w terenie przez osoby spoza laboratoriów do badania całych próbek. Jednakże szybkie testy immunologiczne nie są tak czułe i nie mogą być używane do dokładnego oznaczania ilościowego analitu (samodzielne monitorowanie poziomu glukozy we krwi przez diabetyków jest uważane za szybkie testy ilościowe, jednakże technologia testów immunologicznych nie jest wykorzystywana do tych testów). Wszystkie szybkie testy immunologiczne mogą być przekształcone w testy na płytkach mikrotitracyjnych, ale nie wszystkie testy na płytkach mikrotitracyjnych mogą być przekształcone w szybkie testy.
.