PMC

Wśród ssaków, autotomia wydaje się ewoluować kilka razy, ale jest taksonomicznie nieliczna. Udokumentowana autotomia jest zwykle ograniczona do ogona i występuje poprzez utratę nasady ogona (fałszywa autotomia) lub poprzez złamanie w poprzek kręgu (prawdziwa autotomia)2,5. Oprócz autotomii ogona, od czasu do czasu wspomina się o gatunkach ssaków ze słabą lub delikatną skórą, chociaż to, czy zwierzęta te są zdolne do autotomii skóry pozostaje nieznane. Tak więc, najpierw staraliśmy się zbadać niepotwierdzone dowody, że dwa gatunki afrykańskiej myszy kolczastej (Acomys kempi i Acomys percivali) łatwo rzuca części ich skóry jako drapieżnika ucieczki behavior.

Aby przetestować hipotezę, że A. kempi i A. percivali są zdolne do autotomii skóry, żyjemy-trapped osobników na skaliste wychodnie (kopjes) w środkowej Kenii. Poza włoskami ochronnymi, gatunki z rodzaju Acomys odznaczają się obecnością na grzbiecie włosków przypominających kolce (ryc. 1a, b). Obchodzenie się z oboma gatunkami w terenie potwierdziło, że energiczne poruszanie się często prowadziło do rozdarcia skóry. Rozdarcie prowadziło do powstania dużych otwartych ran lub utraty skóry, od małych fragmentów do obszarów stanowiących około 60% całkowitej powierzchni grzbietu (Rys. 1c). Oprócz utraty tkanki łącznej, oba gatunki wykazywały autotomię nasady ogona, jak wcześniej opisywano u innych gatunków Acomys, a osobniki były często chwytane z brakującymi ogonami2. U osobników schwytanych w niewoli obserwowaliśmy szybkie gojenie się poważnych ran skórnych, a szybki odrost kolczastych włosów całkowicie zasłaniał zranione miejsce (ryc. 1d, e). Osobniki schwytane w terenie wykazywały podobne gojenie, a w niektórych przypadkach wzorzyste mieszki włosowe w fazie anagenu (tj. fazie wzrostu), które wydawały się regenerować w zranionych miejscach (ryc. 1f).

Aby ocenić, jak skóra Acomys tak łatwo się rozrywa, zapytaliśmy, czy właściwości mechaniczne skóry Acomys mogą leżeć u podstaw jej obserwowanej słabości. Na podstawie eksperymentów badających autotomię skóry u gekonów3, słabą skórę (tj. skórę posiadającą jednolite właściwości strukturalne, która ulega uszkodzeniu lub pęknięciu pod stosunkowo niewielkim obciążeniem) można odróżnić od skóry kruchej (tj. skóry posiadającej specyficzne cechy morfologiczne, takie jak płaszczyzna pęknięcia, która pozwala na uwolnienie zewnętrznych warstw). Aby ocenić słabość skóry, porównaliśmy właściwości mechaniczne skóry Acomys i Mus. Podczas obciążenia mechanicznego, skóra Mus wykazywała właściwości elastyczne przed pęknięciem, podczas gdy skóra Acomys była krucha i zaczynała się rozrywać wkrótce po przyłożeniu obciążenia (Rys. 2a). Uzyskaliśmy krzywe naprężenie-odkształcenie dla skóry grzbietowej w celu określenia średniej wytrzymałości na rozciąganie (σm) i stwierdziliśmy, że skóra Mus była 20 razy mocniejsza niż skóra Acomys (2,3 MPa ±0,19 i 0,11 MPa ±0,03) (Ryc. 2a, b). Wreszcie, obliczając średnią twardość (W), okazało się, że do rozerwania skóry Mus potrzeba prawie 77 razy więcej energii niż w przypadku skóry Acomys (ryc. 2b). Wyniki te pokazują, że Acomys posiadają skórę, która łatwo się rozrywa (lub pęka) w odpowiedzi na niskie przyłożone napięcie i dostarczają mechanicznej podstawy dla słabości ich skóry.

Aby ocenić, czy właściwości strukturalne skóry Acomys przyczyniają się do jej mechanicznej słabości, zbadaliśmy cechy komórkowe skóry A. percivali i stwierdziliśmy, że jest ona anatomicznie porównywalna do skóry Mus i innych gryzoni, aczkolwiek ma znacznie większe mieszki włosowe (ryc. 2c, d). Nie znaleźliśmy dowodów na istnienie płaszczyzny pęknięcia, która jest mechanizmem autonomii skóry u gekonów i skinksów3. Badając włókna elastyny, które zwiększają elastyczność skóry, stwierdziliśmy, że wszystkie trzy gatunki mają podobne rozmieszczenie i obfitość elastyny w skórze właściwej i pod panniculus carnosus (ryc. S1a-f). Sprawdziliśmy, czy większe mieszki włosowe w skórze Acomys zmniejszają całkowitą powierzchnię skóry właściwej zajętą przez tkankę łączną, badając udział przydatków (np. mieszków włosowych i związanych z nimi gruczołów) w skórze właściwej i okazało się, że był on większy u A. percivali (55,61% ±4,28) w porównaniu do M. musculus (43,65% ±4,62) (t=1,9, P=0,043) (ryc. 2e, f). Wyniki te sugerują, że chociaż podstawowa struktura tkankowa skóry Acomys jest podobna do skóry Mus, przestrzeń zajmowana przez przydatki w skórze właściwej zmniejsza bezwzględną zawartość tkanki łącznej, potencjalnie przyczyniając się do zmniejszonej elastyczności i mniejszej wytrzymałości na rozciąganie, gdy skóra jest poddawana naprężeniom6. Brak płaszczyzny złamania podkreśla to ustalenie i wspiera wrodzoną różnicę strukturalną leżącą u podstaw zaobserwowanej słabości skóry Acomys.

Zważywszy na jej wrodzoną słabość strukturalną i skłonność do rozdarcia, oceniliśmy zdolność Acomys do gojenia się ran skóry przy użyciu małych (4mm) i dużych (1,5cm), pełnej grubości ran wyciętych (FTE). W ranach obu rozmiarów tworzenie strupów i hemostaza były szybkie, a w dużych ranach przyczyniły się do zmniejszenia powierzchni rany o 64% ±3,1 w 24 godziny po urazie (ryc. S2a). Podczas gojenia bez blizny u salamander lądowych7 i płodów ssaków8, łożysko rany ulega ponownej epitelializacji w ciągu kilku dni, podczas gdy 4 mm rana w skórze dorosłego szczura wymaga 5-7 dni do ponownej epitelializacji9. U Acomys stwierdziliśmy, że pięć z sześciu 4-milimetrowych ran uległo całkowitej reepitelializacji do 3. dnia po urazie (D3), podczas gdy rany Mus nie uległy tak szybkiej reepitelializacji (ryc. 2g, h). Po reepitelializacji, ssaki o luźnej skórze (np. gryzonie, króliki, itp.) polegają głównie na kurczeniu się, aby zagoić swoje rany10. Podobnie, zaobserwowaliśmy wysoki współczynnik skurczu, który stanowił 95% zamknięcia rany po 17 dniach (Rys. S2a-c). W przeciwieństwie do bliznowacenia, gdzie włókna kolagenowe organizują się w gęstą sieć równoległą do naskórka, podczas gojenia bez blizny włókna kolagenowe przyjmują układ podobny do niezranionej skóry właściwej10. Badając macierz zewnątrzkomórkową (ECM) w D10, zaobserwowaliśmy bliznowacenie u Mus, podczas gdy u Acomys, włókna kolagenowe były mniej gęsto upakowane i miały bardziej porowatą strukturę (Ryc. 2i, j). Używając czerwieni pikrosirusa stwierdziliśmy, że kolagen typu I dominował w łożysku rany w D10 u Mus, podczas gdy kolagen typu III występował w większej ilości u Acomys (Rys. 2k, l). Różnica ta była jeszcze bardziej widoczna w ranach o długości 1,5 cm (ryc. S3a-b’). Dane te pokazują, że szybka reepitelializacja i obkurczanie się brzegów rany znacznie zmniejsza rozmiar otwartych rozdarć skóry u Acomys. Nasze odkrycia, że ECM rany (1) odkłada się powoli, (2) ma porowatą konfigurację i (3) jest zdominowany przez kolagen typu III, sugerują, że ten skład sprzyja regeneracji nad zwłóknieniem podczas naprawy skóry u Acomys.

Aby sprawdzić zdolność regeneracyjną środowiska rany, pobraliśmy próbki dużych gojących się ran w poszukiwaniu dowodów neogenezy mieszków włosowych i regeneracji skóry właściwej. W połączeniu z bardziej porowatą ECM, zaobserwowaliśmy genezę mieszków włosowych normalnych włosów pelagicznych i dużych włosów kolczastych w łożysku rany pomiędzy D21 i D28 i mogliśmy odróżnić stare, duże mieszki w pobliżu brzegów rany od nowo zregenerowanych mieszków w łożysku rany (Fig. 3a-d i Fig. S3c-e). Nowe mieszki włosowe regenerowały się w całej niezakontrastowanej części łożyska rany, a nie tylko w centralnym regionie (Ryc. 3c i Ryc. S3e) i zaobserwowaliśmy regenerujące się mieszki włosowe w różnych stadiach rozwoju (Ryc. 3a-m i Ryc. S4a-c). Zlokalizowana i wysoce proliferacyjna populacja komórek epidermalnych napędza rozwój mieszków włosowych i zaobserwowaliśmy podobne zjawisko podczas regeneracji mieszków włosowych (Fig. 3e i Fig. S4a-c). Aby zbadać, czy embrionalne sieci sygnalizacyjne wykorzystywane podczas rozwoju mieszków włosowych zostały wykorzystane podczas ich regeneracji, zbadaliśmy keratynę-17 (Krt17), która ulega rozproszonej ekspresji w naskórku podczas rozwoju skóry i stopniowo ogranicza się do rozwijających się mieszków włosowych11. Po ponownej epitelializacji, KRT17 była wysoce wzbogacona w neoepidermie pokrywającej łożysko rany w D14, a w miarę tworzenia się nowych mieszków włosowych w łożysku rany, KRT17 ograniczała się do nabłonka mieszków włosowych (Ryc. 3f i Ryc. S5). Podczas naprawy rany u Mus, stwierdziliśmy, że KRT17 był również wysoce wyregulowany w zreepitalizowanym naskórku w D14 (Fig. S5) i chociaż KRT17 zlokalizował się do niektórych keratynocytów podstawnych w naskórku Mus w D21, miejsca te nie zdołały się zagregować w placody lub nowe mieszki włosowe, tak że KRT17 był całkowicie nieobecny w nowym naskórku w D26 (Fig. 3f). Zanik KRT17 z bazalnych keratynocytów u Mus, wraz z naszą obserwacją ciągłej lokalizacji w nowych placodach i mieszkach włosowych u Acomys, sugeruje brak podstawowych sygnałów skórnych wymaganych do indukcji tworzenia placod u Mus.

Aczkolwiek dokładny sygnał dla tworzenia placod pozostaje niejasny, istnieje absolutny wymóg dla sygnalizacji Wnt podczas normalnego tworzenia pęcherzyków12. Jądrowa lokalizacja białka LEF1 została wykorzystana jako odczyt tej indukcyjnej sygnalizacji13. Wykryliśmy jądrową akumulację LEF1 w regenerujących się łożyskach naskórka, kondensujących fibroblastach skóry właściwej pod zarodkiem włosa oraz w komórkach brodawki skórnej i komórkach macierzy (ryc. 3g, h i ryc. S6a). Wykryliśmy również jądrowe barwienie LEF1 na niskim poziomie w niektórych nie-plakodowych keratynocytach podstawnych, podczas gdy nie wykryliśmy jądrowego LEF1 w naskórku podczas gojenia się ran u Mus, sugerując, że naskórkowa aktywacja Wnt u Acomys może częściowo leżeć u podstaw naszych obserwacji regeneracji mieszków włosowych (Fig. S6b, c).

Regulacja kanonicznej sygnalizacji Bmp odgrywa również rolę podczas indukcji mieszków włosowych i różnicowania populacji progenitorowych mieszków włosowych w dojrzałe mieszki włosowe (przegląd w14). Fosforylacja SMAD 1, 5 i 8 (pSMAD1/5/8) jest silnym wskaźnikiem kanonicznej sygnalizacji Bmp. Wykryliśmy pSMAD1/5/8 na niskim poziomie podczas indukcji mieszków włosowych, a później na wyższym poziomie w brodawce skórnej i komórkach macierzy przechodzących różnicowanie w cebulce włosa (ryc. 3i, j). Dodatkowo, w niektórych regenerujących się mieszkach włosowych wykryliśmy brodawkę skórną SOX2 pozytywną, co jest zgodne z jej rolą w specyfikowaniu różnych typów włosów podczas rozwoju mieszków włosowych u myszy15 (ryc. 3k). Łącznie, wyniki te pokazują, że regenerujące się mieszki włosowe u Acomys przechodzą przez określone etapy rozwoju mieszków włosowych, wykazują wysokie tempo proliferacji i ponownie wykorzystują szlaki molekularne wykorzystywane podczas rozwoju embrionalnych mieszków włosowych do regeneracji nowych mieszków włosowych.

Skóra dorosłych ssaków jest normalnie niezdolna do regeneracji struktur pochodzących z naskórka w odpowiedzi na zranienie (np. gruczoły i mieszki włosowe). Wyjątkiem jest obserwacja spontanicznej genezy mieszków włosowych w dużych ranach po wycięciu u królików, a ostatnio u myszy laboratoryjnych (C57BL6/SJ, SJL lub szczep mieszany)16,17,18. Króliki są również jednym z niewielu gatunków ssaków zdolnych do regeneracji dużych ran po nakłuciach uszu19. Postawiliśmy hipotezę, że zdolności regeneracyjne obserwowane u Acomys mogą obejmować również ich tkankę uszną. Aby to sprawdzić, wykonaliśmy 4-milimetrowe nakłucia uszu obu gatunków Acomys i, ku naszemu zaskoczeniu, okazało się, że są one zdolne do zamykania tych dużych nakłuć (ryc. 4a-c i ryc. S7a-c). Nieuszkodzona tkanka ucha zawiera skórę (naskórek i skórę właściwą), związane z nią mieszki włosowe, komórki tłuszczowe, mięśnie i chrząstki; stwierdziliśmy, że Acomys były w stanie całkowicie zregenerować wszystkie te tkanki z wysoką wiernością, z wyjątkiem mięśni (ryc. 4b-c). Dwanaście dni po zranieniu zaobserwowaliśmy nagromadzenie komórek na obwodzie rany pod naskórkiem i chociaż regeneracja nowej tkanki była dośrodkowa, komórki gromadziły się w większym stopniu po proksymalnej stronie nakłuwacza. Regeneracja mieszków włosowych i chrząstek przebiegała falą od proksymalnej do dystalnej (ryc. 4d, e) i podobnie jak w przypadku skóry, naskórek mieszków włosowych w uchu aktywował sygnalizację Wnt (ryc. S6d, e). W przeciwieństwie do Acomys, Mus nie był w stanie zregenerować 4-milimetrowych nakłuć ucha i zamiast tego tworzył tkankę bliznowatą (Ryc. S8a, b). Co ciekawe, pomimo tworzenia się blizny, naprawa ucha przez Mus skutkowała tworzeniem się de novo kondensacji chrząstki dystalnie od przeciętej chrząstki, co sugeruje, że Mus może inicjować, ale nie utrzymywać, odpowiedź regeneracyjną po zranieniu ucha (ryc. S8b).

Pozostaje niejasne, czy regeneracja ssaków przebiega poprzez tworzenie blastemy, czy też jest przesadną wersją wzrostu hiperplastycznego20,21,22. Tworzenie blastemy uważane jest za cechę charakterystyczną regeneracji epimorficznej. Jedną z cech blastemy regeneracyjnej jest to, że zawiera ona proliferujące komórki i utrzymuje proliferację podczas regeneracji23. Zaobserwowaliśmy powszechną proliferację w całym regeneracie ucha u Acomys i, co zaskakujące, w całej gojącej się tkance ucha u Mus (ryc. 4f, g). Jednakże, zauważyliśmy brak proliferacji w dystalnym naskórku Acomys, podczas gdy wykryliśmy proliferację w całym naskórku Mus rozciągającym się aż do dystalnej końcówki (ryc. 4f, g). Podczas gdy proliferacja była zachowana w uszach Acomys, nie zaobserwowaliśmy prawie żadnych proliferujących komórek w uszach Mus w późniejszym stadium rozwoju (ryc. 4h, i).

Drugą cechą charakterystyczną blastemy jest tworzenie się wyspecjalizowanego naskórkowego centrum sygnalizacyjnego (wound epidermis), które jest wymagane dla proliferujących komórek blastemalnych, aby pozostały w cyklu komórkowym24 i charakteryzuje się utratą stratyfikacji naskórka, utratą polarności bazalnych keratynocytów i brakiem dojrzałej blaszki podstawnej25. Po reepitelializacji u Acomys zauważyliśmy pogrubienie naskórka dystalnego, dezorganizację keratynocytów podstawnych i brak dojrzałej błony podstawnej (ryc. 4j). Dla porównania, naskórek w pobliżu płaszczyzny amputacji wykazywał normalną stratyfikację i posiadał wyraźną błonę podstawną (ryc. 4k). W przeciwieństwie do tego, Mus zdawał się tworzyć naskórek rany jedynie przejściowo po reepitelializacji, przy czym proporcjonalnie mniejszy obszar dystalny wykazywał te cechy przez krótki czas (dane nie pokazane). W D12 u Mus, barwienie kolagenu typu IV ujawniło dojrzałą błonę podstawną pod całym naskórkiem gojącego się ucha (ryc. 4l). Ponadto, naskórek wykazywał normalne rozwarstwienie i prawidłową polaryzację wierzchołkowo-podstawną keratynocytów podstawnych (ryc. 4g, l).

Oprócz podtrzymywania proliferacji i tworzenia się naskórka rany, cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) odgrywają kluczową rolę we wspieraniu proliferacji i kierowaniu późniejszym różnicowaniem podczas regeneracji26. W przeciwieństwie do nich, cząsteczki takie jak laminina i kolagen typu I, które sprzyjają różnicowaniu, są wyciszane w blastemie podczas regeneracji kończyn płazów i ulegają ekspresji w miarę postępu różnicowania układu mięśniowo-szkieletowego26,27. Badanie histologiczne uszu Acomys w D12 wykazało wysoki poziom fibronektyny (FN), trochę tenascyny-C (TN-C) otaczającej gęsto upakowane komórki, ale bardzo niski poziom kolagenu typu I (ryc. S9a-c). Kolagen typu III był również bardziej obfity niż kolagen typu I podczas regeneracji (ryc. S9d-d’). TN-C został ograniczony do obszarów, w których nowa chrząstka zaczęła się różnicować, a w obrębie tych różnicujących się komórek stwierdziliśmy aktywację szlaku sygnałowego Bmp w komórkach dających początek nowej chrząstce małżowiny usznej (ryc. 4o i ryc. S10). Podczas hiperplastycznego wzrostu w uszach Mus, ECM początkowo wykazywał wysoki poziom FN i niski poziom TN-C, tak jak w uszach Acomys, ale produkował relatywnie wyższy poziom kolagenu typu I (Ryc. S9e-g). Produkcja kolagenu u Mus była nie tylko szybsza i bardziej obfita, ale także wykazywała wyższy stosunek kolagenu typu I do III (ryc. S9h, h’). Biorąc pod uwagę wybujałą produkcję kolagenu typu I w Mus, zapytaliśmy, czy fibroblasty rezydentów różnicują się w miofibroblasty, które przyczyniają się do bliznowacenia zamiast regeneracji (omówione w28). Używając aktyny mięśni gładkich alfa (αSMA), znaleźliśmy miofibroblasty w dużej ilości w całej tkance ucha u Mus, podczas gdy były one prawie całkowicie nieobecne w uszach Acomys (ryc. 4m, n). Dane te potwierdzają znaczenie ECM rany do promowania proliferacji podczas antagonizowania różnicowania i wspierają poprzednią pracę pokazującą przedwczesne tworzenie kolagenu typu I antagonizuje regenerację wyrostka robaczkowego27.

Nasze dane sugerują, że regeneracja reparacyjna ucha u Acomys jest równowagą między przedwczesną reformacją skóry właściwej (bliznowacenie) i utrzymaniem proliferacji komórek w środowisku proregeneracyjnym. Z kolei Mus nie tworzy (lub nie utrzymuje) naskórka rany, co jest zbieżne z przedwczesnym tworzeniem się błony podstawnej i rozwarstwieniem naskórka. Prowadzi to do utraty proliferacji komórek, zwiększonego odkładania się kolagenu typu I (zamiast kolagenu typu III), aktywacji miofibroblastów i ostatecznie do tworzenia się blizn. Podczas gdy nasze dane sugerują, że regeneracja ucha ma podobne cechy jak tworzenie się blastemy, zrozumienie sygnałów molekularnych wymaganych do organizacji i utrzymania zranionego naskórka oraz identyfikacja linii regenerujących się komórek jest kluczowa dla odpowiedzi na pytanie, jak dochodzi do regeneracji u tych zwierząt. Przyszłe prace badające, w jaki sposób Acomys są zdolne do kontrolowania włóknienia, rzucą światło na to, jak regeneracja i bliznowacenie mogą być zrównoważone w obliczu infekcji i zapalenia u dzikich ssaków i stanowią idealny system modelowy, w którym można zbadać epimorficzną regenerację u ssaków.

.