Abstract
Objective. Wyjaśnienie wpływu Lactobacillus plantarum 299v na poziom ślinowego kortyzolu i ślinowego IgA u młodych dorosłych w stresie egzaminacyjnym. Projekt. Czterdziestu jeden studentów z nadchodzącym egzaminem akademickim zostało włączonych do randomizowanego, podwójnie ślepego, kontrolowanego placebo badania. Bakterie probiotyczne lub produkt placebo podawano w kapsułkach raz dziennie przez 14 dni. Przy każdej okazji pobierania próbek pobierano ślinę i wypełniano test odczuwanego stresu. Ślinę pobrano do analizy kortyzolu metodą elektrochemiluminescencyjną (ECLI), a ślinę IgA analizowano metodą immunoenzymatyczną (ELISA). Liczebność bakterii Lactobacillus oceniano poprzez hodowlę śliny na podłożu selektywnym, a identyfikację L. plantarum 299v przeprowadzono na losowo wybranych koloniach metodą losowej amplifikacji polimorficznego DNA (RAPD). Wyniki. Stwierdzono istotną różnicę w poziomie kortyzolu pomiędzy grupą leczoną a grupą placebo () oraz istotny wzrost poziomu lactobacillusów w grupie leczonej w porównaniu z grupą placebo (). Nie stwierdzono istotnych zmian dla ślinowego IgA. Wnioski. Bakteria probiotyczna o zdolności do redukcji objawów zespołu jelita drażliwego (IBS) zabroniła zwiększonego poziomu markera stresu – kortyzolu w okresie badania. Numer rejestracyjny badania to NCT02974894, a badanie jest zarejestrowane w serwisie ClinicalTrials.gov.
1. Wstęp
Istnieje związek między przewodem pokarmowym a stresem fizjologicznym, a ślinowy kortyzol i ślinowa immunoglobulina A (ślinowa IgA) mogą być brane jako markery stresu . Kortyzol jest hormonem steroidowym uwalnianym przez nadnercza w odpowiedzi na stres, a podwyższone poziomy zostały powiązane z tłumieniem układu odpornościowego. Ślinowa IgA jest częścią obrony immunologicznej jamy ustnej i najobficiej występującym przeciwciałem w ślinie, głównie w postaci wydzielniczej IgA . Drobne gruczoły ślinowe, rozmieszczone na całej błonie śluzowej jamy ustnej, wydzielają około 30-35% całej śliny IgA, która występuje w całej ślinie dorosłego człowieka.
Probiotyki definiuje się jako „żywe mikroorganizmy, które podawane w odpowiednich ilościach przynoszą gospodarzowi korzyści zdrowotne”. L. plantarum 299v w poprzednich badaniach wykazał pozytywny wpływ na objawy zespołu jelita drażliwego (IBS), takie jak wzdęcia i ból. Wykazano również, że szczep ten przeciwdziała nieszczelności jelit, co z kolei może osłabiać reakcję osi podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA) na stres. Nie przeprowadzono wcześniejszych badań nad wpływem L. plantarum 299v na stany związane ze stresem. Jednakże wykazano, że u szczurzych szczeniąt zestresowanych oddzieleniem od matki, mieszanina probiotyków Lactobacillus rhamnosus R0011 i Lactobacillus helveticus R0052 znacząco obniżyła poziom kortykosteronu, analogu kortyzolu we krwi zwierząt. Również szczury poddane ostremu, ograniczonemu w czasie stresorowi stały się mniej zestresowane po leczeniu Lactobacillus farciminis, wraz z obniżonym poziomem lipopolisacharydów (LPS) we krwi .
Niewiele wiadomo o wpływie bakterii probiotycznych na markery stresu w ślinie, pomimo faktu, że pobieranie próbek śliny jest łatwą i nieinwazyjną metodą, która nie powoduje u badanego żadnej szkody ani dyskomfortu. Jest to szczególnie ważne przy ocenie markerów stresu, gdzie ostry wzrost może być spowodowany metodą pobierania próbek, a nie ostrym stresorem ocenianym w badaniu. Jeśli chodzi o wpływ probiotyków na poziom ślinowego IgA, większość badań dotyczy występowania różnych infekcji układu oddechowego, a w poprzednim badaniu stwierdzono, że poziom wydzielniczego IgA w stolcu wzrósł w grupie dzieci otrzymujących produkt zawierający L. rhamnosus HN001 w porównaniu z grupą placebo. Podobne wyniki uzyskano w przypadku szczepu L. rhamnosus GG .
Przewlekły stres jest związany z podwyższonym poziomem kortyzolu, ale to, czy kortyzol jest czynnikiem sprawczym fizjologicznych reakcji stresowych, czy tylko ich konsekwencją, jest przedmiotem dyskusji. Uwolnienie kortyzolu jest opóźniona obwodowa odpowiedź na ostry stres i sugeruje się, że kortyzol wywiera zarówno stymulujące i tłumiące działania na odpowiedź organizmu na stres. Przykładem działania stymulującego jest wywołanie aktywacji układu sercowo-naczyniowego; jednak w odpowiedzi na, na przykład, stresor krwotoczny, kortyzol tłumi odpowiedź zmniejszonej objętości płynu poprzez hamowanie początkowego szybkiego wydzielania wazokonstrykcyjnych hormonów stresu. Jeśli chodzi o immunoregulacyjne właściwości kortyzolu, sugeruje się, że jego wydzielanie chroni przed „przestrzeleniem” odpowiedzi immunologicznej, które w przeciwnym razie następuje w odpowiedzi na stres. Jednak nie jest jeszcze jasne, do jakich celów służy podwyższony poziom kortyzolu podczas odpowiedzi organizmu na stres .
W obecnym badaniu głównym celem było wyjaśnienie wpływu bakterii probiotycznych Lactobacillus plantarum 299v na poziom kortyzolu w ślinie u młodych dorosłych w stresie badania. Jako alternatywne markery stresu oznaczano ślinowe IgA z mniejszych gruczołów oraz w całej ślinie ludzkiej. Hipoteza zakładała, że poziom kortyzolu zostanie obniżony lub ustabilizowany w grupie badanej, w porównaniu z grupą placebo, w której spodziewano się wzrostu poziomu kortyzolu z powodu stresu wywołanego egzaminem. Oczekiwano natomiast, że poziom ślinowej IgA wzrośnie w grupie testowej w porównaniu z grupą placebo.
2. Materiały i metody
2.1. Projekt badania
W niniejszym randomizowanym, podwójnie ślepym, kontrolowanym placebo badaniu wzięli udział studenci Uniwersytetu w Lund, w wieku od 18 do 30 lat, podczas okresu egzaminacyjnego. Kryteriami wykluczającymi była ciąża, jak również przyjmowanie antybiotyków i tymczasowych leków kortyzonowych w okresie badania. W celu określenia liczby badanych przeprowadzono kalkulację mocy, a 40 osób uznano za wystarczającą liczbę. Do badania zgłosiło się 42 zdrowych młodych dorosłych, 28 kobiet i 14 mężczyzn, a wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę na udział w badaniu. Po tym jak jeden mężczyzna zrezygnował z udziału w badaniu, 41 osób ukończyło cały okres eksperymentalny. 21 otrzymywało produkt badany w dawce dziennej 1 1010 jednostek tworzących kolonię L. plantarum 299v w kapsułkach (L. plantarum 299v, skrobia ziemniaczana, hydroksypropylometyloceluloza i stearynian magnezu, (Probi AB, Lund, Szwecja)), a 20 otrzymywało kapsułki placebo, zawierające te same składniki co produkt badany z wyjątkiem bakterii. Przed rozpoczęciem okresu eksperymentalnego przeprowadzono dwutygodniowy okres „wash-out”, w którym uczestnicy zostali poinstruowani, aby unikać spożywania produktów probiotycznych. Następnie badani przyjmowali kapsułkę raz dziennie po obiedzie i zostali poproszeni o nie jedzenie, nie picie, nie palenie i nie zażywanie tabaki przez godzinę po przyjęciu kapsułki. Uczestnicy zostali również poinstruowani, aby albo żuć kapsułkę do momentu rozpuszczenia proszku w ustach (minimum 30 sekund) lub opróżnić kapsułkę na łyżeczkę i żuć proszek przez 30 sekund przed spożyciem. Próbki referencyjne dla wszystkich uczestników zostały pobrane w dniu 0, przed jakimkolwiek spożyciem produktu. Badanie trwało 14 dni, a data rozpoczęcia była ustalana indywidualnie dla wszystkich uczestników, w ciągu 1,5 tygodnia.
2.2. Ocena psychologiczna
Do badania włączono ocenę psychologiczną, aby badani mogli ocenić odczuwany przez siebie stres. Wykorzystano kwestionariusz zawierający 30 pytań opracowany przez Levensteina i wsp. Uzyskany niższy wynik wskazuje na niższy stopień stresu i odwrotnie. Indeks dający liczbę od 0 do 1 został obliczony przy użyciu następującego wzoru:
2.3. Pobieranie próbek śliny
Ślina gruczołów mniejszych została pobrana z dolnych obszarów błony śluzowej warg, jak opisano wcześniej, a cała ślina została pobrana w tym samym dniu pobierania próbek. Aby ograniczyć wpływ zmian okołodobowych w wydzielaniu śliny podczas pobierania próbek, wszystkie próbki pobierano między godziną 15 a 17. Wszystkie próbki były pobierane w dniu 0 i 14, a w dniach 5 i 10 pobierano tylko próbki kortyzolu. Uczestnicy zostali poinstruowani, aby nie jeść, nie pić, nie zażywać tabaki, nie palić, nie myć zębów i nie wykonywać żadnych ćwiczeń na godzinę przed pobraniem próbek. Alkohol był również zabroniony na dwanaście godzin przed umówionym pobraniem próbki.
2.4. Analiza kortyzolu
Pobieranie śliny do analizy kortyzolu przeprowadzono za pomocą urządzenia Salivette® for cortisol (Sarstedt, Niemcy) i wykonano je po pobraniu śliny do analizy IgA. Uczestnicy zostali poinstruowani, aby przez 2-5 min krążyć świstkiem w ustach, aż do wypełnienia go śliną, a następnie ostrożnie wypluć go z powrotem do probówki. Probówki umieszczano na lodzie, a następnie zamrażano w temperaturze -20°C do czasu analizy. Analiza kortyzolu została przeprowadzona przez Labmedicin Skåne (laboratoria uniwersyteckie i regionalne w Regionie Skåne, Szwecja) i została wykonana zgodnie z akredytacją. Zastosowano metodę jednoetapowego testu kompetycyjnego z techniką detekcji Electrochemiluminescence Immunoassay (ECLI) opartą na pochodnej rutenu (Ru) .
2.5. Analiza śliny IgA
Ślinę gruczołową pobierano z dolnej wargi za pomocą paska SialoPaper® (Oraflow Inc., Nowy Jork, USA) i delikatnie umieszczano na błonie śluzowej na 60 s, a objętość śliny w obrębie paska mierzono za pomocą urządzenia Periotron® 8000 (Oraflow Inc., Nowy Jork, USA). Pasek SialoPaper umieszczano w 1 mL PBS (1,5 mL PP, Sarstedt, Niemcy; Phosphate Buffered Saline, Dulbecco A, Oxoid, Anglia) na lodzie i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy. Niestymulowana ślina została pobrana po pobraniu próbek śliny z gruczołów mniejszych. Uczestnicy siedzieli, pochylając się lekko do przodu, i pozwalali ślinie spłynąć do mikroprobówki o pojemności 2 mL za pomocą sterylnej słomki (1 mL sterylne pipety jednorazowe, Kemikalia, Szwecja; 2 mL PP, Sarstedt, Niemcy). Wszystkie próbki przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy.
Stężenie IgA wydzielanej w ślinie jest względne w stosunku do całkowitej ilości białka i dlatego wybrano jednostkę % IgA/białko całkowite, aby przedstawić wynik analizy całej śliny. Jest to istotne, ponieważ wydzielanie IgA zmienia się wraz z szybkością przepływu śliny, która z kolei zmienia się pod wpływem bodźców działających na autonomiczny układ nerwowy, np. ostrego stresu, przewlekłego stresu i odpoczynku. Tę zmianę w szybkości przepływu uwzględnia się poprzez pomiar % IgA/białko całkowite w ślinie, co sprawia, że jest to dokładna metoda przy porównywaniu danych pochodzących od różnych osób badanych .
W celu przeanalizowania stężenia IgA w ślinie przeprowadzono zmodyfikowaną metodę sandwich-ELISA zgodnie z Krzywkowskim i wsp. przy użyciu specyficznych dla łańcucha α1- i α2 kozich anty-ludzkich IgA (5 μg/ml, Sigma I0884; Sigma Chemical Co, Louis, MO, USA) sprzężonych z fosfatazą alkaliczną (Sigma A9669; rozcieńczone 1 : 30 000 w PBST). Stężenie białka całkowitego analizowano za pomocą szybkostartowego testu białkowego (BIO-RAD) .
Ślinowa IgA w ślinie gruczołu mniejszego została wyrażona w mg/100 mL. Analiza ślinowej IgA została przeprowadzona na Wydziale Odontologii Uniwersytetu w Malmö (Malmö, Szwecja).
2.6. Liczba płytek bakterii Lactobacillus
W celu przeprowadzenia analizy bakterii Lactobacillus w jamie ustnej badani żuli pastylkę parafinową (Orion Diagnostics), aby pobudzić wydzielanie śliny, a pobranie próbki odbywało się w taki sam sposób, jak w przypadku ślinowej IgA w całej ślinie. Próbkę śliny pobierano pod koniec każdego pobierania próbek, ponieważ ta metoda pobierania próbek daje silnie stymulowaną ślinę, w przeciwieństwie do innych metod. Probówki umieszczano na lodzie i 0,25 mL próbki śliny przenoszono do innej sterylnej mikroprobówki (1,5 mL PP, Sarstedt, Niemcy), która zawierała 0,5 mL podłoża zamrażającego. Obie probówki przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy.
Obfitość bakterii z rodzaju Lactobacillus oceniano na podstawie liczby płytek. Próbki rozcieńczono i rozprowadzono na płytkach agarowych Rogosa (Oxoid, Anglia), a płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 72 godziny w warunkach beztlenowych (2,5 L, AnaeroGen™, Oxoid). Z każdej płytki wybierano losowo po dwie kolonie i poddawano je rekultywacji. Izolaty zamrażano i przechowywano w podłożu mrożącym w temperaturze -80°C.
2.7. Identyfikacja L. plantarum 299v
Do ekstrakcji DNA każdego izolatu próbki rozmrażano i wirowano krótko przed dodaniem 1 mL sterylnej wody MilliQ i odwirowaniem przy maksymalnej prędkości (14 800 g, 1 min). Supernatant został usunięty i dodano kolejne 0,25 mL sterylnej wody MilliQ. Pozostały ekstrakt komórkowy został gładko zmielony ze sterylnymi kulkami szklanymi Assistent® (Ø 2 mm, Glaswarenfabrik Karl Hecht, Niemcy) w wytrząsarce (6°C, 30 min), a następnie wszystkie próbki zostały użyte w reakcji losowej amplifikacji polimorficznego DNA (RAPD), w celu zbadania występowania L. plantarum 299v. Przygotowano mastermix dla 35 próbek zawierający 175 μL buforu (Qiagen, Niemcy), 35 μL dNTP (Roche Diagnostics, Niemcy), 35 μL Primera 73 (Qiagen, Niemcy) i 8,75 μL Taq-Polimerazy (Qiagen, Niemcy). Do każdej probówki PCR (Gene Amp 0,5 mL, Applied Biosystems, Singapur) dodano 7,25 μL mastermixu wraz z 42,75 μL H2O i 1 μL supernatantu próbek.
Reakcję RAPD przeprowadzono w maszynie PCR (Perkin Elmer, DNA Thermal Cycler, USA) wg Quednau i wsp. Żele do elektroforezy żelowej przygotowywano przez dodanie 0,75 g Agarose DNA Grade Electran® (VWR, Belgia) do 50 mL buforu TB; następnie roztwór ogrzewano do wrzenia i wylewano do zbiorników żelowych w celu ostygnięcia. Żele ostatecznie umieszczano w żelownikach z buforem TB. Do każdej studzienki dodawano 2-5 μL każdej próbki wraz z 3 μL buforu obciążającego przed rozpoczęciem elektroforezy (100 V, 1 h). Gel Redx3 (Biotium Inc., USA), 1 mL w 99 mL dH2O, stosowano przez 20 min do barwienia żeli, a zdjęcia wykonywano zgodnie z zaleceniami Quednau i wsp.
2.8. Obliczenia statystyczne
Dane zostały ocenione statystycznie przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) Kruskala-Wallisa na rangach lub testu sumy rang Manna-Whitneya, gdy było to właściwe. Do porównania parami bezwzględnych stężeń IgA oraz bezwzględnych poziomów kortyzolu użyto testu A -test. Narzędziami statystycznymi były Sigma Plot (11.0 i 12.0) oraz Excel 2013. Ponadto przeprowadzono test częstości występowania L. plantarum 299v za pomocą testu Fishera Exact, wykorzystując program QuickStat (2.6). Dane przedstawiono w postaci mediany i rozstępu międzykwartylowego, a także średniej i odchylenia standardowego. Minimalne i maksymalne wartości dla próbek kortyzolu zostały usunięte w celu usunięcia wpływu wartości odstających, ponieważ w danych można było zaobserwować wyraźne odchylenie. Dotyczyło to tylko próbek kortyzolu. Wartości należące do uczestników, którzy nie spełnili wszystkich wymogów badania, zostały poddane kontroli i nie stwierdzono, aby odbiegały od normy. Ich wyniki zostały zatem uwzględnione.
2.9. Zezwolenie etyczne
Badanie zostało zatwierdzone przez Regionalną Komisję Przeglądu Etycznego w Lund (Ref 2013/166), a względy etyczne obejmowały korzyści i ryzyko z zastosowanym produktem oraz możliwość już istniejących relacji osobistych między odpowiedzialnym personelem badawczym a uczestnikami badania prowadzącymi badanie.
3. Wyniki
3.1. Ocena psychologiczna
Ocena psychologiczna nie wykazała istotnej różnicy w odczuwanym stresie pomiędzy grupami, a dodatkowo nie było istotnej różnicy w obrębie każdej z grup przy porównaniu różnych dni pobierania próbek.
3.2. Poziomy kortyzolu w ślinie
Bezwzględne poziomy kortyzolu (nM) w dniu referencyjnym (dzień 0) wynosiły 9,18 (±2,50) w grupie placebo i 9,47 (±2,96) w grupie badanej, bez istotnej różnicy między tymi dwiema grupami (). Kiedy względna zmiana mediany poziomu kortyzolu została porównana z wartością referencyjną w dniu 0 (linia podstawowa), stwierdzono istotną różnicę między grupami w dniu 10 (; Figura 1). Nie stwierdzono istotności w obrębie grup.
3.3. Stężenia IgA w ślinie
Bezwzględne poziomy IgA (mg/100 mL) w ślinie gruczołu mniejszego w dniu referencyjnym (dzień 0) wynosiły 1,99 (±3,76) w grupie placebo i 4,80 (±9,17) w grupie badanej, bez istotnej różnicy między tymi dwiema grupami (). Bezwzględne poziomy IgA (% IgA / całkowite białko) w całej ślinie w dniu referencyjnym (dzień 0) wynosiły 25,3 (±7,37) w grupie placebo i 27,1 (±12,2) w grupie badanej, bez istotnej różnicy między obiema grupami (). W przeciwieństwie do zmieniających się poziomów kortyzolu, mediana stężeń ślinowych IgA w całej ślinie lub ślinie z gruczołów mniejszych nie została zmieniona przez spożycie probiotyków; to znaczy, nie wykazano istotnej różnicy między grupą probiotyków a grupą placebo (ryc. 2 i 3, resp.).
3.4. Viable Count of Lactobacillus and Identification of L. plantarum 299v
W 14 dniu nastąpił istotny wzrost liczebności lactobacillus w ślinie osób badanych spożywających probiotyki w porównaniu do osób otrzymujących produkt placebo (). Wzrost ten był również istotny () w grupie probiotyków, gdy porównywano poziom wyjściowy z ostatnim dniem pobierania próbek (, Rycina 4). Częstość występowania izolatów zidentyfikowanych jako L. plantarum 299v była znacząco zwiększona w dniu 14 u osób z wykrywalnymi poziomami laktobakterii, zarówno w porównaniu z grupą placebo, jak i z linią podstawową ().
4. Dyskusja
Większość uczestników miała swój egzamin przed końcem badania, co spowodowało pozorny, ale nieistotny (), szczyt odczuwanego stresu w dniu 10 dla grupy placebo. Zbiega się to ze szczytem stężenia kortyzolu ślinowego w grupie placebo w dniu 10 (ryc. 1). W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano szczytu w grupie probiotyków, co sugeruje, że spożywanie probiotyków miało wpływ na stres postrzegany jako wydzielanie kortyzolu z nadnerczy. W dniu 14 wielu ochotników zakończyło egzaminy i dlatego można było oczekiwać spadku kortyzolu, ponieważ kortyzol stosunkowo szybko reaguje na ostre stresory.
Stres akademicki, tutaj w postaci okresu egzaminacyjnego, nie może być uważany za stres przewlekły, ponieważ uczestnicy widzą koniec stresującego okresu. Sugeruje się zatem, że stres akademicki jest bardziej podobny do stresu ostrego w odniesieniu do reakcji stresowej. Poziomy kortyzolu w obecnym badaniu były w tym samym zakresie, co zostało wcześniej zgłoszone dla ostrego stresu .
Stres przewlekły jest związany z trwałym zwiększonym wydzielaniem kortyzolu. To jest ostatnio dyskutowane, czy jest to rzeczywiste zwiększone poziomy kortyzolu lub raczej jak tkanki docelowe reagują na zwiększone poziomy, które jest przyczyną wielu chorób i objawów związanych z przewlekłym stresem. Wiadomo, że długotrwały wzrost poziomu glukozy we krwi może prowadzić do utraty mięśni, akumulacji tłuszczu, redystrybucji i ewentualnej cukrzycy. Stąd możliwym celem dla probiotyków mogłyby być osoby przewlekle zestresowane, u których utrzymujący się podwyższony poziom kortyzolu zwiększa ryzyko rozwoju chorób związanych z przewlekłym stresem.
Ogólnie występują duże różnice indywidualne w mierzonych poziomach ślinowego IgA, co utrudnia próby dostrzeżenia różnic między małymi grupami osób. Jednak mediany wartości w różnych grupach dobrze odpowiadają tym podawanym przez innych. Obecne wyniki z całych próbek śliny wykazały, że wartości między placebo i grupą badaną nie różniły się znacząco od siebie i że mediany wartości w obu grupach były podobne. Patrząc na względną zmianę w każdej grupie, wartość mediany była nieznacznie dodatnia w grupie probiotyków, podczas gdy w grupie placebo była nieznacznie ujemna. Porównując z 25. i 75. percentylem, w grupie placebo zaobserwowano wzrost większej części wykrytych poziomów śliny IgA, co utrudnia wyciągnięcie jakichkolwiek wniosków (ryc. 2). Stresory powodujące przewlekły stres zostały powiązane z obniżonym poziomem ślinowego IgA , podczas gdy ostry stres okazał się zwiększać poziom, co wskazuje na aktywację odpowiedzi immunologicznej. Można zatem zasugerować, że stresor w tym badaniu jest bardziej prawdopodobny jako ostry niż przewlekły.
Wcześniejsze badania wykazały tendencję sugerującą, że probiotyki mogą zwiększać poziom ślinowego IgA podczas stresu . Jednak osoby badane w obecnym badaniu przyjmowały probiotyki tylko przez okres dwóch tygodni i chociaż w tej grupie odnotowano znacznie wyższy poziom laktobakterii, być może okres badania był zbyt krótki, aby zaobserwować wyraźne zmiany na poziomie indywidualnym. Ze względu na duże różnice indywidualne w poziomie ślinowego IgA, pożądana byłaby również zwiększona liczba uczestników w każdej grupie.
Wykryto, że poziom ślinowego IgA w ślinie gruczołu mniejszego jest wyższy niż podawany przez innych, co może być spowodowane różnicami indywidualnymi lub wynikać z projektu badań w tej pracy. Na przykład, wobec uczestników zastosowano określony poziom stresu i rodzaj stresu, czego nie zastosowano w badaniu przeprowadzonym przez Sonesson i in. Dane ze śliny gruczołu mniejszego wykazały, że wartości mediany były wyższe w grupie badanej niż w grupie placebo, ale różnica między grupami nie była znacząca. Wzrost wydaje się być większy w grupie otrzymującej probiotyki w porównaniu do grupy placebo, ale względna zmiana wartości mediany jest w przybliżeniu taka sama w obu grupach. Jednak słupki błędów wskazują na duże różnice w grupie otrzymującej probiotyki, co może wyjaśniać sprzeczność (ryc. 3).
Krótki stres naturalistyczny, w tym stres akademicki, ma być gdzieś pomiędzy stresem ostrym a przewlekłym w odniesieniu do wzrostu lub spadku markerów stresu. Ponieważ stresor jest trudny do zdefiniowania w odniesieniu do rodzaju stresu, który jest stosowany i ponieważ indywidualny stres stosowany do każdego uczestnika mógł być inny, nieistotne różnice znalezione są zgodne z teorią, w jaki sposób IgA może odzwierciedlać stres. Być może łatwiej byłoby zaobserwować zmiany w ślinie IgA, gdyby okres badania był dłuższy lub gdyby dodatkowe próbki zostały pobrane tydzień lub dwa tygodnie po badaniu, ponieważ w innych badaniach zaobserwowano spadek poziomu IgA również jakiś czas po doświadczonym stresie. Innym wyjaśnieniem może być to, że chociaż uczestnikom kazano zapisywać wszelkie zmiany w ich stanie zdrowia (np. incydenty przeziębienia), nie było to kontrolowane ani porównywane z wartościami odstającymi w danych dotyczących ślinowego IgA. Przeziębienia i inne infekcje dróg oddechowych prawdopodobnie spowodowałyby wzrost poziomu śliny IgA, ponieważ IgA jest częścią pierwszej linii obrony układu odpornościowego przed patogenami.
W grupie probiotycznej nastąpił znaczący wzrost poziomu bakterii z grupy lactobacillus, również w porównaniu z grupą placebo, co pokazuje, że podawane bakterie mogły przetrwać w jamie ustnej (rysunek 4). Potwierdza to również wynik oznaczenia RAPD, wskazujący na występowanie L. plantarum 299v w próbkach, w których poziom lactobacillus był powyżej granicy wykrywalności. Wydaje się więc, że istnieje związek pomiędzy zwiększoną obecnością bakterii probiotycznych a obniżonym poziomem kortyzolu w ślinie.
5. Wnioski
Istnieje istotna różnica w odpowiedzi wydzielania kortyzolu pomiędzy osobami badanymi, którym podawano probiotyki lub placebo, prawdopodobnie w związku ze stresem. Ponadto zaobserwowano znaczący wzrost poziomu pałeczek kwasu mlekowego w grupie otrzymującej probiotyki w porównaniu z grupą placebo. W przeciwieństwie do tego nie stwierdzono żadnego znaczenia dla ślinowego IgA.
Konkurencyjne interesy
Irini Lazou Ahrén jest pracownikiem firmy Probi AB. Produkt i kapsułki placebo zostały dostarczone przez firmę Probi AB. Nie należy zgłaszać żadnych innych konkurencyjnych interesów.
Wkład autorów
Dwie pierwsze autorki, Hannah Andersson i Cecilia Tullberg, wniosły równy wkład w powstanie tej pracy, a pierwsze autorstwo jest wspólne.
Podziękowania
Autorzy dziękują Jie Xu i Marie Kala, Uniwersytet Lund, za pomoc laboratoryjną.