Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cinnamaldehyde

Selection of enzymes for cinnamaldehyde biosynthesis

Cinnamaldehyd może być syntetyzowany z l-fenyloalaniny, a jego biosynteza wymaga trzech reakcji enzymatycznych: (i) deaminacji l-fenyloalaniny do kwasu cynamonowego przez liazę fenyloalanino-amoniakalną (PAL, EC 4.3.1.24), (ii) ligacji kwasowo-tiolowej kwasu cynamonowego do cynamoilo-CoA przez ligazę 4-kumaranową:CoA (4CL, EC 6.2.1.1.12), oraz (iii) redukcja cynamoilo-CoA do aldehydu cynamonowego przez reduktazę cynamoilo-CoA (CCR, EC 1.2.1.44) (Rys. 1a). PAL jest wszechobecnym enzymem, który można znaleźć w wielu roślinach, grzybach i niektórych bakteriach, a jego aktywność i specyficzność jest różna w zależności od pochodzenia enzymu. Zbadaliśmy dwa enzymy PAL, jeden z rośliny Arabidopsis thaliana (AtPAL), a drugi z bakterii Streptomyces maritimus (SmPAL), pod kątem ich przydatności do produkcji kwasu cynamonowego w E. coli. W przypadku AtPAL, istnieją cztery izomery, w tym AtPAL1 do AtPAL4, a wcześniej donoszono, że większość z nich (AtPAL1, 2 i 4) ma podobnie wyższą aktywność niż AtPAL3 do l-fenyloalaniny jako substratu, więc wybraliśmy AtPAL1 jako przedstawiciela ze źródła roślinnego. Ich stałe kinetyczne (Km) wynosiły odpowiednio 68 i 23 μM. Każdy znakowany Hisem enzym PAL został wyprodukowany w E. coli BL21(DE3) i oczyszczony zgodnie z procedurami opisanymi w „Metodach”. Oba enzymy, AtPAL1 (78 kDa) i SmPAL (56 kDa), zostały z powodzeniem oczyszczone (Dodatkowy plik 1: Rysunek S1). Chociaż poziom ekspresji AtPAL1 nie był tak wysoki, że pasmo nie mogło być widoczne w pasach 1 i 2 SDS-PAGE, pasmo AtPAL1 mogło być wyraźnie widoczne po chromatografii kolumnowej powinowactwa w pasie 3, w którym załadowano skoncentrowany eluent. Równoważna molarność każdego oczyszczonego enzymu PAL była inkubowana z taką samą ilością l-fenyloalaniny (jako substratu), a miano produkcyjne kwasu cynamonowego było określane ilościowo za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (plik dodatkowy 2: Rysunek S2). Jak pokazano na Rys. 1b, SmPAL wykazywał znacząco wyższą aktywność (21-krotnie w reakcji w 30 °C i 27-krotnie w reakcji w 37 °C) niż AtPAL1.

Zbadaliśmy również dwa różne enzymy 4CL, jeden ze Streptomyces coelicolor (ScCCL) i drugi z A. thaliana (At4CL), pod kątem ich przydatności do konwersji kwasu cynamonowego do aldehydu cynamonowego w E. coli. W przypadku At4CL wiadomo, że istnieje 14 potencjalnych izoform (At4CL1-At4CL14). Spośród 14 izoform, At4CL1-3 wykazują podobną aktywność wobec cynamonianu, podczas gdy pozostałe izoformy nie. Dlatego wybraliśmy At4CL1 jako reprezentatywną. Użyliśmy również enzymu CCR z A. thaliana (AtCCR1) do konwersji cynamoilo-CoA w aldehyd cynamonowy. Każdy z enzymów 4CL (At4CL1 i ScCCL ) był testowany w połączeniu z enzymem CCR z A. thaliana (AtCCR). Wszystkie enzymy zostały z powodzeniem oczyszczone z wysoką czystością (plik dodatkowy 1: Rysunek S1). Aby porównać aktywność enzymatyczną At4CL1 i ScCCL, przygotowano dwie reakcje, (i) At4CL1 z AtCCR oraz (ii) ScCCL z AtCCR, i zmieszano je z kwasem cynamonowym jako substratem. Po inkubacji w temp. 30 i 37 °C miano aldehydu cynamonowego analizowano metodą HPLC. Jak pokazano na Rys. 1c, kombinacja ScCCL i AtCCR skutkowała wyższym mianem produkcji aldehydu cynamonowego (4,4-krotnie w reakcji w 30 °C i 10,4-krotnie w 37 °C) niż kombinacja At4CL1 i AtCCR. W oparciu o te wyniki skonstruowaliśmy system biosyntezy cynamaldehydu w E. coli, jak opisano poniżej, używając następujących enzymów: SmPAL, ScCCL, i AtCCR.

Konstrukcja szlaku biosyntezy cynamaldehydu w E. coli

Aby wyprodukować cynamaldehyd w E. coli, geny SmPAL, ScCCL, i AtCCR zostały sklonowane do pTrc99A w następującej kolejności: SmPAL, ScCCL, i AtCCR (dając pHB-CAD) (Rys. 2a). Hodowlę E. coli W3110 zawierającą pHB-CAD prowadzono w dwóch różnych temperaturach (30 i 37°C) w celu znalezienia optymalnej temperatury dla produkcji aldehydu cynamonowego. Ekspresję enzymów analizowano za pomocą SDS-PAGE, a następnie analizy western blot, jak opisano w „Metodach”. W obu temperaturach wszystkie enzymy ulegały ekspresji i były wysoce rozpuszczalne (Rys. 2b). Chociaż każdy enzym ulegał ekspresji na różnym poziomie, ekspresja każdego z nich była nieznacznie lepsza w temperaturze 37 °C niż w 30 °C. Również analiza miana cynamaldehydu produkowanego w medium hodowlanym przy użyciu HPLC wykazała, że miano produkcyjne cynamaldehydu było 4,5-krotnie wyższe w 37 °C niż w 30 °C (Rys. 2c). Przypuszczamy, że wyższe miano produkcyjne aldehydu cynamonowego w 37 °C było spowodowane zwiększonym poziomem ekspresji wszystkich enzymów biosyntetycznych aktywnie działających w 37 °C, mimo że enzymy te są aktywne w 30 °C. W dalszej części artykułu wszystkie hodowle do produkcji aldehydu cynamonowego prowadzono w temperaturze 37 °C.

Inżynieria szczepów w celu zwiększenia wewnątrzkomórkowej puli l-fenyloalaniny

Do biosyntezy aldehydu cynamonowego wymagana jest l-fenyloalanina jako niezbędny prekursor. Dlatego, aby zwiększyć produkcję cynamonaldehydu, pożądane jest zwiększenie wewnątrzkomórkowej puli l-fenyloalaniny. W tym celu, racjonalnie przeprojektowaliśmy E. coli do produkcji l-fenyloalaniny więcej. Używając dostępnych informacji metabolicznych i regulacyjnych jako przewodnika, zaprojektowaliśmy E. coli W3110 w następujący sposób: (i) delecja genu crr, który koduje białko EIIAGlc związane ze specyficznym dla glukozy układem fosfotransferazy fosfoenolopirogronianowej (PTS) w celu moderowania szybkości pobierania substratów, zmniejszania przepełnienia metabolitów i wzbogacania prekursorów, (ii) delecja genu tyrR w celu złagodzenia ścisłej regulacji regulonu tyrR, który zawiera geny syntezy aminokwasów aromatycznych (AAA), (iii) delecja genów trpE (składnik syntazy antranilanowej) i tyrA, aby zapobiec utracie przepływu węgla do konkurencyjnych szlaków (biosyntezy l-tryptofanu i l-tyrozyny) oraz (iv) delecja genu pykA (kinaza pirogronianowa A) w celu wzbogacenia prekursora i zrównoważenia strumienia pomiędzy wzrostem a produkcją l-fenyloalaniny (Rys. 3). 3). W oparciu o powyższy schemat opracowano pięć sekwencyjnych mutantów knockout E. coli W3110 (YHP01-YHP05) (Tabela 1).

Po pierwsze, specyficzny dla glukozy fosfoenolopirogronianowy PTS został unieczynniony przez delecję genu crr w szczepie E. coli W3110, uzyskując E. coli YHP01. Chociaż zaburza to główny system internalizacji glukozy, YHP01 może nadal rosnąć w zdefiniowanych podłożach zawierających glukozę jako jedyne źródło węgla, ponieważ PTS specyficzny dla mannozy i permeaza galaktozy mogą nadal internalizować glukozę do cytoplazmy. Ominięcie PTS skutkuje zwiększoną pulą fosfoenolopirogronianu (PEP), który ostatecznie ułatwia syntezę l-fenyloalaniny. Następnie, usunęliśmy gen tyrR w YHP01, aby otrzymać szczep YHP02. Białko tyrR jest regulatorem regulonu TyrR, który zawiera osiem genów zaangażowanych w biosyntezę AAA. Jego delecja może również zwiększyć pulę l-fenyloalaniny poprzez złagodzenie ścisłej regulacji genów związanych z syntezą AAA. Następnie sekwencyjnie usuwaliśmy geny trpE i tyrA, począwszy od szczepu YHP02, uzyskując odpowiednio szczepy YHP03 i YHP04. W szlaku biosyntezy AAA występuje końcowy punkt rozgałęzienia, w którym chorizmat może być przekształcony do l-fenyloalaniny, l-tryptofanu lub l-tyrozyny przez enzymy odpowiednio PheA, TrpE lub TyrA. Delecje genów trpE i tyrA mogą zapobiegać utracie węgla w konkurencyjnych szlakach biosyntezy l-tryptofanu i l-tyrozyny. Wreszcie, usunęliśmy gen pykA z YHP04, aby otrzymać szczep YHP05. Gen pykA koduje kinazę pirogronianową A (PykA), która stanowi drugi etap zużywający PEP. Delecja genu pykA pozwala na wykorzystanie większej ilości PEP w szlaku shikimatowym, a w konsekwencji na produkcję większej ilości l-fenyloalaniny. W każdym szczepie (YHP01-YHP05), delecja genów została zweryfikowana przez PCR i elektroforezę w żelu agarozowym (Dodatkowy plik 3: Figura S3).

Wszystkie zmodyfikowane szczepy E. coli, w tym YHP01-YHP05 i rodzicielski E. coli W3110, hodowano w wytrząsanych kolbach zawierających półzdefiniowane pożywki i porównywano wzrost komórek i produkcję l-fenyloalaniny. Po 48 h hodowli wszystkie zmodyfikowane szczepy rosły nieco lepiej niż szczep W3110; w szczególności szczep E. coli YHP05 wykazywał największą gęstość komórek (Rys. 4a). We wcześniejszych badaniach zaobserwowano również, że inaktywacja izozymów PTS i Pyk zwiększa strumień węgla do tworzenia biomasy ze względu na efekt zachowania zmniejszonych ilości metabolitów pośrednich wynikających z obniżonego wychwytu i katabolizmu glukozy. Analizowaliśmy również miano produkcyjne l-fenyloalaniny w supernatancie hodowli metodą HPLC. W macierzystym szczepie W3110, miano produkcyjne l-fenyloalaniny wynosiło 0,24 g/L, ale miano l-fenyloalaniny było stopniowo zwiększane w zmodyfikowanych szczepach E. coli (Rys. 4a). E. coli YHP05, u której usunięto geny crr, tyrR, trpE, tyrA i pykA, wykazywała najwyższe miano l-fenyloalaniny (0,52 g/L), które było 2,2-krotnie wyższe niż u rodzicielskiej E. coli W3110. Dlatego zdecydowaliśmy się użyć szczepu E. coli YHP05 do dalszej inżynierii.

Plazmidowy system nadekspresji w celu zwiększenia wewnątrzkomórkowej puli l-fenyloalaniny

Począwszy od szczepu E. coli YHP05, produkcja l-fenyloalaniny była dalej ulepszana przez nadekspresję genów opartą na plazmidach. Hamowanie zwrotne w szlaku syntezy l-fenyloalaniny przez shikimat i l-fenyloalaninę zostało zmniejszone przez nadekspresję izozymów lub wprowadzenie mutacji w enzymach zaangażowanych w szlak shikimatu w następujący sposób: (i) nadekspresja genu syntazy 7-fosforanu 3-deoksy-d-arabinoheptulosonianu (DAHP), który jest kodowany w aroG z inżynierią (AroG8/15), (ii) nadekspresja genów ydiB i aroK, które kodują dehydrogenazę shikimatu i kinazę shikimatu w celu zwiększenia przepływu węgla do szlaku shikimatu, (iii) nadekspresję genu pheA kodującego mutazę CHA/ dehydratazę prefenianową z inżynierią poprawiającą powinowactwo wiązania substratu (PheAfbr, dm) oraz (iv) nadekspresję genów galP (permeaza galaktozy) i glk (glukokinaza) w celu ułatwienia wychwytu glukozy (Dodatkowy plik 4: Figura S4).

Po pierwsze, w celu złagodzenia inhibicji sprzężenia zwrotnego, skonstruowano plazmid pTac15kG, który zawierał zmodyfikowany gen aroG8/15. AroG jest głównym enzymem biorącym udział w syntezie DAHP, ale AroG jest całkowicie hamowany przez l-fenyloalaninę (już od 0,1 mM) . Wiadomo, że wprowadzenie dwóch mutacji (D146N i A202T) spowodowało oporność na inhibicję sprzężenia zwrotnego bez wpływu na jego wysoką aktywność specyficzną (AroG8/15), więc dokonaliśmy nadekspresji tego zmutowanego enzymu AroG8/15. Następnie skonstruowano dwie plazmidy (pTac15kGB i pTac15kGBK) w celu nadekspresji odpowiednio genów ydiB i aroK wraz z genem aroG8/15. Strumień metaboliczny do szlaku shikimatowego może być zwiększony, gdy dehydrogenaza shikimatowa (YdiB) i kinaza shikimatowa (AroK) są nadekspresjonowane. Następnie skonstruowano również plazmid pTac15kGBKA w celu nadekspresji genu pheA, który koduje mutazę chorizmatu/ dehydratazę prefenianu z mutacjami. W tym konstrukcie amplifikowaliśmy tylko pierwsze 300 aminokwasów PheA typu dzikiego (PheAfbr), co wyklucza domenę regulacyjną; dlatego PheAfbr jest pod słabym wpływem inhibicji sprzężenia zwrotnego. Ponadto, ponieważ PheAfbr ma wyższą wartość Km niż dziki typ PheA, co odzwierciedla jego zmniejszone powinowactwo do substratu, wprowadziliśmy dwie mutacje (E159A i E232A) w PheAfbr, aby zwiększyć jego powinowactwo do substratu, dając PheAfbr, dm . Wreszcie, plazmid pYHP został skonstruowany w celu nadekspresji genów galP i glk, które kodują odpowiednio permeazę galaktozy i glukokinazę. Oba enzymy ułatwiają wychwyt glukozy.

Po skonstruowaniu pięciu plazmidów, w tym pTac15kG, pTac15kGB, pTac15kGBK, pTac15kGBKA i pYHP (Tabela 1), każdy plazmid transformowano do E. coli YHP05. Po hodowli przez 48 h w wytrząsanych kolbach zawierających pożywki półrozpuszczalne, analizowano wzrost komórek i miano wytwarzanej l-fenyloalaniny. Wszystkie komórki rosły dobrze, a w szczególności E. coli YHP05 niosąca pYHP rosła do nieznacznie większej gęstości komórek (OD600 = 9,76) niż pozostałe (Rys. 4b). Analizowaliśmy również miano produkcyjne l-fenyloalaniny w supernatancie hodowli metodą HPLC. Nadekspresja genu aroG8/15 (pTac15kG) spowodowała znaczący wzrost produkcji l-fenyloalaniny (2,25 g/L) w porównaniu z YHP05 nie zawierającym plazmidu (0,52 g/L) (Rys. 4b). Dalsza nadekspresja innych genów powodowała seryjny wzrost miana produkcyjnego l-fenyloalaniny, a E. coli YHP05 niosąca pYHP wykazywała najwyższe miano produkcyjne l-fenyloalaniny (3,91 g/L) (Rys. 4b). Efektem zastosowania plazmidu pYHP był znaczący wzrost produkcji l-fenyloalaniny, odpowiednio 16,4-krotny i 7,5-krotny. W hodowlach E. coli YHP05 zawierających pYHP, wydajność l-fenyloalaniny w stosunku do glukozy i produktywność wynosiły odpowiednio 0,270 g/g i 0,082 g/L/h (plik dodatkowy 5: Rysunek S5). Tak więc, w zmodyfikowanej E. coli YHP05 posiadającej pYHP, pula l-fenyloalaniny uległa znacznej poprawie. Liu i wsp. wcześniej donosili o produkcji l-fenyloalaniny w E. coli aż do 47 g/L . Jednak rekord ten mógł być osiągnięty w hodowli wsadowej (w skali 15 L) i zastosowali oni koekspresję transportera l-fenyloalaniny (YddG) w celu wydajnej produkcji l-fenyloalaniny do podłoża hodowlanego. W naszej pracy, nie wprowadziliśmy YddG, ponieważ ostatecznym celem naszej pracy nie była produkcja l-fenyloalaniny, ale produkcja aldehydu cynamonowego. Chociaż miano l-fenyloalaniny uzyskane w naszej pracy nie było rekordowo wysokie, myśleliśmy, że było wystarczająco wysokie do produkcji aldehydu cynamonowego. Dlatego zdecydowaliśmy się na użycie tego zmodyfikowanego szczepu do produkcji aldehydu cynamonowego.

Produkcja aldehydu cynamonowego w zmodyfikowanej E. coli

Używając zmodyfikowanej E. coli YHP05 unoszącej pYHP, najpierw zbadaliśmy produkcję kwasu cynamonowego. Do tego eksperymentu skonstruowano plazmid pHB-CA, który zawiera gen SmPAL pod indukowanym IPTG promotorem trc (Tabela 1). Hodowle E. coli YHP05 zawierające zarówno pHB-CA jak i pYHP prowadzono w kolbach przez 48 h, a następnie analizowano miano wytwarzanego kwasu cynamonowego. Jako kontrolę wykorzystano również E. coli YHP05 i E. coli W3110 zawierające pHB-CA (bez pYHP). Wzorce wzrostu wszystkich komórek były podobne (rys. 5a), a E. coli W3110 i YHP05 zawierające pHB-CA produkowały odpowiednio 79 i 108 mg/L kwasu cynamonowego (rys. 5b). E. coli YHP05 wykorzystująca zarówno pHB-CA jak i pYHP wykazywała znacznie lepsze miano produkcyjne (287 mg/L), które było 3,6-krotnie i 2,7-krotnie wyższe niż w przypadku E. coli W3110 i YHP05 wykorzystującej pHB-CA, odpowiednio (Rys. 5b). Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, to miano produkcyjne było również 1,5-krotnie wyższe niż najwyższy poziom (186 mg/L) odnotowany u E. coli . Wynik ten wyraźnie wskazuje, że podniesienie ilości l-fenyloalaniny w zmodyfikowanym szczepie E. coli pozytywnie przyczynia się do zwiększenia produkcji kwasu cynamonowego.

Jako główny cel, zbadaliśmy produkcję aldehydu cynamonowego w zmodyfikowanym szczepie E. coli YHP05, który został przekształcony za pomocą pHB-CAD i pYHP. Ponadto, E. coli YHP05 i E. coli W3110 zawierające pHB-CAD (bez pYHP) były badane jako kontrole. Wzrost komórek był podobny (Rys. 6a), a trzy enzymy biosyntezy aldehydu cynamonowego wykazywały dobrą ekspresję we wszystkich badanych komórkach (plik dodatkowy 6: Rysunek S6). Po 48 h hodowli w kolbie zbierano supernatanty hodowli i oznaczano miana produkcyjne aldehydu cynamonowego metodą HPLC. E. coli W3110 (pHB-CAD) i E. coli YHP05 (pHB-CAD) wykazywały miana produkcyjne aldehydu cynamonowego wynoszące odpowiednio 2,18 i 6,3 mg/L (Rys. 6b). Przeciwnie, E. coli YHP05 (pHB-CAD i pYHP) wykazywała znacznie wyższe miano produkcyjne (75 mg/L), które było 35-krotnie wyższe niż E. coli W3110 (pHB-CAD).

Aktywność nematyczna aldehydu cynamonowego wytwarzanego przez zmodyfikowane E. coli

Aby ocenić aktywność nematyczną aldehydu cynamonowego wytwarzanego w pożywce hodowlanej, nicienie, B. xylophilus, poddano działaniu aldehydu cynamonowego zgodnie z procedurami opisanymi w „Metodach” . Supernatant hodowli E. coli YHP05 z pYHP i pHB-CAD był rozcieńczany do końcowego stężenia cynamaldehydu wynoszącego 60 mg/L, a nicienie traktowano rozcieńczonym supernatantem hodowli. Po 1 i 4 h przeżyło odpowiednio tylko 26% i poniżej 18% nicieni (ryc. 7). Jako kontrolę pozytywną zastosowano dostępny w handlu i oczyszczony aldehyd cynamonowy w równoważnym stężeniu (60 mg/L). Po 4 godzinach prawie wszystkie nicienie (95 %) zostały zabite. Wyniki te wskazują, że aktywność nicieniobójcza była podobna pomiędzy komercyjnie zakupionym aldehydem cynamonowym a wyprodukowanym w tym badaniu. Jako kontrolę negatywną zbadano również supernatant hodowli E. coli W3110 i zgodnie z oczekiwaniami, prawie wszystkie nicienie przeżyły (>92 %) po 4 h.

.